免疫組化，是應(yīng)用免疫學基本原理--抗原抗體反應(yīng)的一個實驗。以成為病理診斷不可或缺的重要手段，隨著試劑盒的不斷優(yōu)化，正確率也在不斷提高。但免疫組化實驗過程步驟繁多，稍不注意容易影響結(jié)果。本人談?wù)劰ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)的注意事項。

1、切片：3-4微米

免疫組化實驗是一個以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的實驗項目。所以抗原的多少直接影響實驗的質(zhì)量。所以石蠟切片的厚度為3～4微米較好，過厚，石蠟切片在修復時容易掉片，過薄，影響目的部位的表達，不利于診斷。

2、載玻片：硅化玻片

石蠟切片貼在載玻片上進行免疫組化染色，由于染色過程操作步驟及洗片次數(shù)較多，容易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，所以，用硅化玻片承載蠟片。

3、烤片：溫度60℃～65℃、時間2～4小時

為什么要選擇60℃～65℃呢？因為病理科常用的石蠟多為硬蠟。其熔點在60℃左右。組織浸蠟時，浸蠟箱中的溫度一般設(shè)置為65℃左右。

為什么時間是2～4小時呢？其實，切片在60℃～65℃的烤箱內(nèi)烤2～24小時，對抗原的表達沒有影響。只是這個時間比較適合本科的工作。

值得一提的是，烤片后的切片應(yīng)盡快進行染色。如果切片遲遲不染，存放于室溫中或工作冰箱中，切片內(nèi)的抗原會隨著時間的延長而慢慢消失，甚至出現(xiàn)假陰性。原則上是，現(xiàn)切片，現(xiàn)做片，一氣呵成。

4、脫蠟：試劑最好用二甲苯。脫蠟時間參考常規(guī)HE的脫蠟時間。

石蠟切片上的石蠟不容于水，影響組織內(nèi)的抗原與抗體的結(jié)合，所以要用脫蠟劑把石蠟清除掉?，F(xiàn)在市場上有多種脫蠟劑，但效果最好的是二甲苯。二甲苯有毒，所以脫蠟時最好在通風較好的地方進行。

脫蠟的時間要根據(jù)脫蠟劑的使用次數(shù)和現(xiàn)場的溫度而作調(diào)整。脫蠟劑新鮮，室內(nèi)溫度較高，脫蠟時間大概為10分鐘左右。反之，脫蠟劑陳舊，室內(nèi)溫度低，脫蠟時間大概在20分鐘左右。也可以參考常規(guī)HE切片的時間來調(diào)整脫蠟時間。

洗掉石蠟后的切片不能直接至于水中。因為二甲苯不容于水，它粘附于玻片上影響抗原與抗體的結(jié)合、增加或產(chǎn)生背景染色。所以要用酒精洗掉玻片上的二甲苯。如何判斷二甲苯已經(jīng)被清洗干凈呢？在酒精中抽取幾張片子，觀察酒精的流動情況，沒有組織的地方不掛小水珠。然后，把切片置于蒸餾水中，觀察水是否發(fā)白，是否有油狀物漂在水面，如果有，說明切片表面的二甲苯?jīng)]有洗干凈，應(yīng)該重置于無水酒精內(nèi)浸泡或更換新的無水酒精再浸泡。直到切片置于蒸餾水中數(shù)秒再拿起，沒有組織的地方不掛小水珠。此時脫蠟完成。

5、抗原修復：此處僅討論高溫高壓修復，因此法適用范圍較廣。

高壓鍋加熱抗原修復液（檸檬酸或EDTA）至沸騰，放入切片，切片全浸泡在修復液內(nèi)，蓋緊高壓鍋蓋，繼續(xù)加熱至減壓閥噴氣，呈上下跳動樣。這種狀態(tài)持續(xù)3分鐘，停止加熱讓其自然冷卻20分鐘。

實際工作中，我們常縮短這一步的時間。但有一點要注意，修復完畢后不能立刻用人為是方法降溫，要保持高壓鍋內(nèi)部高壓沸騰的狀態(tài)幾分鐘（本人工作中放5分鐘）后，才實行人為降溫。因為大多數(shù)的抗原在高溫高壓的情況下3分鐘可以完全把抗原暴露，但，有一些抗原的要求比較高，需要更長一點的時間才能把抗原完全打開。

6、除去內(nèi)源性過氧化物酶：0.3%的過氧化氫水溶液

身體各組織內(nèi)都含有過氧化物酶，尤其在紅細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、出血組織、壞死組織中含量較多。內(nèi)源性過氧化物酶與辣根過氧化物酶一樣，可與顯色劑DAB、AEC起反應(yīng)而造成假陽性，影響病理醫(yī)生的診斷。因此，在顯色前需除去。此操作可以在修復前、加一抗前或加二抗前進行。

除去內(nèi)源性過氧化物酶常用0.3%的過氧化氫水溶液浸泡10分鐘或用0.3%的過氧化氫甲醇水溶液。甲醇對各種酶都有鈍化的作用，但它有一定的毒性，所以使用時要注意通風

7、檢查所有化學試劑的PH值：PH試紙

常用的洗液為PH7.6的PBS緩沖液。防止用錯試劑或試劑放置過久導致的PH值的改變的情況出現(xiàn)，建議使用PH試紙條測試洗液的PH值。

8、加抗體：要混勻

加抗體前把切片上的洗液盡量擦干，因為切片上的洗液會稀釋抗體的濃度。滴加抗體后要在組織上混勻一下，因為1、組織表面的液體有張力，2、切片上的洗液不是均勻分布的?；靹蚝?，破壞了切片表面的水化膜，也讓切片上的抗體濃度一致。

抗體的覆蓋范圍應(yīng)該不邊緣多2MM。因為在孵育的過程中，抗體會有少量的蒸發(fā)，容易形成邊緣效應(yīng)。所以抗體覆蓋面積要比切片組織面積大。

9、DAB顯色

DAB的顯色時間已鏡下觀察為佳，一些標記細胞漿和細胞膜的組織一旦發(fā)生反應(yīng)，肉眼就能判斷。細胞核和不反應(yīng)的組織參考說明書的推薦時間。顯色完畢后要充分洗干凈切片表面的顯色液，防止本底增高和假陽性的現(xiàn)象出現(xiàn)。

10、一張好的片子，脫水透明很重要。

透明清晰的片子有利于病理醫(yī)生的診斷，所以此處建議在無水酒精脫水后把切片浸泡于石碳酸二甲苯中。石碳酸二甲苯對水分的吸附性強，防止空氣中的水分粘附于切片而影響二甲苯的透明。

制片的質(zhì)量影響病理醫(yī)生的診斷，影響病人的預(yù)后。正確的操作是實驗的基礎(chǔ)，細節(jié)是實驗成敗的關(guān)鍵，因此，我們要認真對待制片的每個環(huán)節(jié)，使實驗更穩(wěn)定，更準確。