摘要：為了提高雞舍環(huán)境的消毒效果，降低雞大腸桿菌病的感染率，提高雞場的經(jīng)濟效益本實驗對河北不同雞舍空氣中的大腸桿菌進行采樣。應(yīng)用玻板凝集試驗鑒定41株大腸桿菌菌株的O抗原血清型。采用周德慶介紹的濾紙片法測定雞舍空氣大腸桿菌對84消毒劑、新歐福、過氧乙酸、聚維酮碘、氨酚五類消毒劑的敏感性，實驗結(jié)果表明雞舍空氣大腸桿菌分別屬于O₂、O₅、O₆₅、O₇₈、O₁₀₁、和O₁₁₉，這五種血清型，O₆₅為分離菌株的優(yōu)勢血清型，占分離菌株的31.71%，占定型菌株的43.33%。雞舍空氣大腸桿菌對不同消毒劑敏感性差異較大。對過氧乙酸的敏感性最高，聚維酮碘與氨酚次之，新歐福及84合劑的敏感性相對較低。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；消毒劑；血清型；耐藥性

中圖分類號：S851.36 文獻標識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）03-0001-04

1文獻綜述

我國養(yǎng)雞業(yè)集約化程度的提高，對雞場環(huán)境污染的防控工作日益成為實現(xiàn)養(yǎng)雞業(yè)良性循環(huán)、提高養(yǎng)殖效益和實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。而微生物的侵入是造成畜禽舍污染的一個重要原因。雞的多種傳染病為氣源性傳染病，病原微生物借助于空氣或以空氣為媒介傳播。畜禽舍內(nèi)致病微生物的傳播、擴散成為影響畜禽健康狀況的主要原因，并且畜禽的環(huán)境情況與蛋雞飼養(yǎng)人員的健康有直接的關(guān)系，因此對畜禽舍中的環(huán)境微生物研究是很重要的。

根據(jù)前人們的這些研究，我們可以得出雞舍環(huán)境存在污染，并且大腸桿菌對環(huán)境的污染也不容小覷。屈鳳琴等對雞舍空氣中致病微生物進行檢測，結(jié)果顯示：雞舍空氣中葡萄球菌、大腸桿菌的污染程度比較嚴重，但沙門氏菌和霉菌的污染程度較小。韓梅英等對雞舍空氣中的大腸桿菌的污染情況進行研究，結(jié)果表明：測定出的6棟雞舍的空氣受大腸桿菌的污染。Wang Jin等對規(guī)模化雞舍空氣中細菌含量進行了檢測，結(jié)果顯示：肉雞飼養(yǎng)中期雞舍內(nèi)空氣中細菌含量比飼養(yǎng)前期和飼養(yǎng)后期高，而風速與細菌含量呈反比，并且使用消毒劑帶雞消毒可以明顯降低雞舍內(nèi)空氣中細菌含量。石玉祥等對規(guī)?；u舍空氣污染情況進行觀察，發(fā)現(xiàn)11棟雞舍中有7棟雞舍受金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌污染，檢出陽性率分別為63.6%、27.27%。

環(huán)境中的微生物存在的必然性不可視而不見，因此環(huán)境消毒是規(guī)?；u舍控制疾病流行的重要環(huán)節(jié)。許多研究人員對雞舍消毒劑的應(yīng)用研究進行探討，蔡會全對抗毒威（二氯異氧尿酸鈉）、過氧乙酸、新潔爾滅（苯扎溴銨）及作者配制的“噴霧靈（5%聚維酮碘溶液）”4種消毒劑在雞舍溫為31℃，相對濕度80%的條件下，用30ml/m³，進行噴霧帶雞消毒，用自然沉降法測定消毒前后空氣中細菌和霉菌含量，計算殺滅率。結(jié)果表明：噴霧后10～30min抗毒威、過氧乙酸、新潔而滅、噴霧靈對細菌殺滅率依次是82.1%、82.9%、90.2%、95.0%，噴霧靈對雞舍中細菌的殺滅效果最佳，至少可維持2小時。趙家喜等對過氧乙酸和百毒殺（癸甲溴銨）帶雞消毒效果進行觀察，試驗結(jié)果表明帶雞消毒可明顯提高肉種雞存活率，但是對其生長發(fā)育并無顯著影響。張紅見等對3種消毒劑百毒殺（癸甲溴銨）、來蘇爾（甲酚）、二氧化氯對3棟雞舍的消毒效果進行觀察，結(jié)果顯示：百毒殺消毒效果最好，其次是來蘇爾，二氧化氯復(fù)合消毒劑消毒效果最差。黃炎困等對雞舍內(nèi)使用5%過氧乙酸噴霧消毒后的消毒效果進行研究，結(jié)果表明：使用5%的過氧乙酸能夠明顯降低雞舍內(nèi)細菌總數(shù)，并且顯示出空氣質(zhì)量越差的雞舍使用5%過氧乙酸消毒后消毒效果越明顯的特點。張順合等研究了固體高氧化電位消毒劑對禽舍空氣質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示：使用固體高氧化電位消毒劑的雞舍空氣中的細菌總數(shù)顯著性地少于對照組，噴霧消毒效果可以維持6h，因此使用檢科Ⅰ號消毒劑進行帶雞消毒可顯著性改善雞舍內(nèi)的空氣質(zhì)量。

本研究主要是研究河北省規(guī)模化雞舍空氣中不同血清型的大腸桿菌對消毒劑耐藥現(xiàn)狀，以闡述河北省規(guī)模化雞舍空氣中不同血清型的大腸桿菌優(yōu)勢血清型與消毒劑耐藥性間的關(guān)系，同時為雞源大腸桿菌病的防治和改善規(guī)模化雞舍空氣質(zhì)量提供科學依據(jù)。以此擬解決的關(guān)鍵問題是確定分離雞舍空氣大腸桿菌菌株的優(yōu)勢血清型及對消毒劑耐藥性，并測定其對5種常用消毒劑的敏感性，分析優(yōu)勢血清型與耐藥性的關(guān)系。

2實驗材料與方法

2.1材料

2.1.1培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號150228

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號141125

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號150113

伊紅美蘭培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號141229

水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂）杭州濱和微生物試劑有限公司批號150104

LB肉湯培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司批號150326

2.1.2藥敏片

常用藥敏試紙杭州天和微生物試劑有限公司

2.1.3生化反應(yīng)管

細菌微量生化反應(yīng)管杭州濱和微生物試劑有限公司

2.1.4實驗消毒劑

均為市售消毒劑。

84合劑山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司規(guī)格：有效氯含量為50g/L 7.5g/L

新歐福瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司規(guī)格：500ml，戊二醛25g+癸甲溴銨25g

過氧乙酸廣州粵豐動物保健有限公司規(guī)格：16.0%～23.0%（g/ml）

聚維酮碘河北地邦動物保健科技有限公司規(guī)格：有效碘0.5%

氨酚江蘇三儀勝意藥業(yè)有限公司規(guī)格：酚41%～49%醋酸22%～26%

2.2實驗方法

2.2.1雞舍空氣大腸桿菌采樣

我們利用TYK-6型六級篩孔撞擊式空氣微生物采樣器在邯鄲、唐山、衡水、邢臺、石家莊地區(qū)不同養(yǎng)殖模式的蛋雞舍進行空氣采樣。

采樣方法：在雞舍四角及中央各設(shè)一個采樣點，將制備的麥康凱平板培養(yǎng)基按順序逐個放入采樣器的圓盤中，用三個彈簧掛鉤把六級圓盤緊密地連接在一起。將六級撞擊器放在高1.5m的支架上，連接主機，開始采樣，每次采樣5min即可。采樣結(jié)束，打開撞擊器，取出采樣平皿，蓋上平皿蓋，用封口膜封住，37℃培養(yǎng)24h備用。整個過程中平皿的放入與取出，動作一定要快，以避免雜菌污染平皿。注意順序和編好號碼，切勿弄錯。

2.2.2細菌分離純化培養(yǎng)

經(jīng)培養(yǎng)24h后將麥康凱平板培養(yǎng)基從恒溫箱取出，挑取疑似菌進行鏡檢，然后將疑似大腸桿菌接種到伊紅美蘭培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h；然后再鏡檢，直到得到純培養(yǎng)物，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3生化試驗

將純化的分離菌，接種到斜面培養(yǎng)基中，于37℃恒溫箱培養(yǎng)24～48h，然后接種于葡萄糖、甘露醇、尿素酶、枸櫞酸鹽、MR試驗、V-P試驗等微量生化反應(yīng)管，按倪語星等報道常規(guī)方法進行生化指標測定。

2.2.4血清學試驗

2.2.4.1單因子血清的配制

將大腸桿菌埃希氏菌單因子血清溶于0.5%石炭酸生理鹽水5ml，裝入小瓶中，蓋緊，備用。

2.2.4.2抗原的制備

將被檢菌株劃線接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24h。在伊紅美蘭培養(yǎng)基上挑取光滑、圓整的黑色帶金屬光澤的菌落1～2個接種至斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。挑取培養(yǎng)物劃線接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，均勻涂布于平皿內(nèi)，置37℃培養(yǎng)24h。

用0.5%石炭酸生理鹽水2ml洗下營養(yǎng)瓊脂平皿上的培養(yǎng)物，倒入5ml的圓底試管中，制成濃稠細菌懸液，在121℃高壓鍋中高壓2h，破壞其“K”抗原，制成高壓“O”抗原。

2.2.4.3玻板凝集試驗

取小圓底試管的高壓抗原與大腸埃希氏菌單因子血清進行玻板凝集試驗。即高壓抗原和血清各取一鉑金耳置玻板上混勻，0.5min至1min中出現(xiàn)明顯凝集者為“陽性反應(yīng)”。同時以高壓抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物做對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。

2.2.4.4結(jié)果判定

“#”——液體完全透明，管底覆蓋明顯傘狀凝集沉淀物

“+++”——液體略呈渾濁，管底傘狀凝集沉淀物明顯。

“++”——液體呈中等程度渾濁，管底有中等量散裝凝集沉淀物。

“+”——液體不透明或透明度不明顯，有不太明顯的傘狀凝集沉淀物。

“-”——液體混濁，無任何凝集沉淀物，細菌可能沉于管底，呈光滑圓盤狀，振蕩時呈均勻混濁。

最終結(jié)果判定：以“++”作為被檢抗原的效價中點。

2.2.5消毒劑對雞舍空氣大腸桿菌的殺菌效果測定

按周德慶（2006）介紹的濾紙片法測定大腸桿菌對消毒劑的敏感性，根據(jù)敏感圈直徑的大小來判定敏感性的標準，20mm以上判為極敏；15～20mm判為高敏；10～14mm判為低敏；10mm以下判為耐藥，即為不敏感。操作方法：將濾紙制成同藥敏片大小的紙片，裝進小瓶中121℃高壓。把純培養(yǎng)物接種到肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h。用滅菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌鑷子夾取濾紙片浸入消毒劑中，之后貼在營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h。觀察抑菌圈的大小，分析結(jié)果。

3結(jié)果與分析

3.1雞舍采集細菌的培養(yǎng)

將采樣的麥康凱平板培養(yǎng)24h后出現(xiàn)不同的菌落。大腸桿菌在麥康凱瓊脂上形成紅色的菌落，然后挑取紅色大小均勻的菌落涂片鏡檢，進行初步鑒定，然后將疑似菌落接種到伊紅美蘭培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，24h。大腸桿菌在伊紅美蘭培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色帶金屬閃光的菌落。挑取黑色帶金屬光澤的單個菌落接種到斜面培養(yǎng)基上進行24h純培養(yǎng)，備用。

3.2大腸桿菌生化鑒定

分離的41株大腸桿菌的生化鑒定結(jié)果符合大腸埃希菌的特征，見表2。

3.3大腸桿菌血清型測定

通過玻板凝集試驗，對41種大腸桿菌進行0血清型鑒定。從表3中可以看出30株大腸桿菌確定了血清型，分別為O₂、O₅、O₆₅、O₇₈、O₁₀₁和O₁₁₉，還有11株未定型。

鑒定出30株雞源大腸桿菌6種0血清型，占分離菌株的73.17%；未定型的11株占分離菌株的26.83%。065為分離菌株的優(yōu)勢血清型，占分離菌株的31.71%，占定型菌株的43.33%；其次為O₁₀₁O₂，分別占定型菌株的23.33%和16.67%。見表4。

23a～23y標號的大腸桿菌是在雞舍健康狀態(tài)下采取的。而14a～14q標號的大腸桿菌是在雞舍爆發(fā)大腸桿菌病的情況下采取的。其血清型比較見表5。

3.4消毒劑對大腸桿菌殺菌效果觀察

消毒劑不同，對大腸桿菌的抑菌效果也會有所差異。通過試驗，得出以下結(jié)果，見圖1與圖2。

由圖我們可以看出，新歐福、過氧乙酸、聚維酮碘、氨酚都可用于日常衛(wèi)生消毒，84也可以只是效果較于其他幾種，效果不顯著。

當雞舍爆發(fā)疾病時，消毒劑選擇非常重要。由圖我們可以看出過氧乙酸作用效果最好，氨酚效果次之，聚維酮碘再次之。

3.5不同血清型對消毒劑的敏感性觀察

雞舍的良好空氣環(huán)境有助于提高雞各方面的機能，尤其是自身的免疫機能。同時降低疾病的爆發(fā)率，提高經(jīng)濟效益。所以，正確的選擇有效的消毒劑是雞舍環(huán)境保護的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。規(guī)模化雞場應(yīng)提高此方面的意識，把風險降到最低，創(chuàng)造可觀的經(jīng)濟效益。