摘要： 以95%乙醇作為提取的溶媒，將加熱回流提取得到的提取液水浴揮干得到浸膏，并用甲醇配制成1 mg·mL1供試液。采用phenomenexC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min1，柱溫為30 ℃，檢測波長為260 nm HPLC色譜法測定，采用國家藥典委員會相似度評價軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明：建立了精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均較好的5味山姜屬中藥乙酸乙酯部位HPLC指紋圖譜，確定了9個共有峰，6個強(qiáng)峰；其中高良姜、大高良姜含有5個共有峰，高良姜和草豆蔻含有3個共有峰，大高良姜和紅豆蔻含有2個共有峰，高良姜和益智含有3個共有峰。對5味山姜屬中藥乙酸乙酯部位化學(xué)成分進(jìn)行相似度分析，得出其相似度分別為0.955、0.805、0.371、0.794、0.345。所建立的5味山姜屬中藥乙酸乙酯部位的指紋圖譜方法穩(wěn)定、簡便、可靠，其特征峰所代表的化學(xué)成分的相似性不盡相同，高良姜、大高良姜、草豆蔻的相似性較大，紅豆蔻、益智的相似性較小，說明同基原中藥之間的化學(xué)成分有一定的相關(guān)性。該研究結(jié)果為探討山姜屬中藥親緣關(guān)系與化學(xué)成分相關(guān)性提供了思路與基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 山姜屬， 中藥， 乙酸乙酯部位， HPLC， 指紋圖譜

中圖分類號： Q946文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 10003142（2017）08106008

Abstract： We established the HPLC fingerprints of ethyl acetate parts from five traditional Chinese medicines （Alpinia officinarum， A. galanga ， A. katsumadai， A. galangal and A. oxyphylla） to study the similarities and differences with the original chemical compositions of Chinese medicines， and to explore the correlation between the genetic relationship and chemical compositions. We firstly analyzed by 95% ethanol extractive， and then explored the correlation between the genetic and chemical compositions using their extractive. The analyzed condition was as follows： C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） by gradient elution with acetonitrile， 0.1% phosphoric acid solution as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min2， the detection wavelength at 260 nm and column temperature at 30 ℃. The data were evaluated using the “similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM” software. The similarities of ethyl acetate parts chemical compositions were as follows： 0.955， 0.805， 0. 371， 0.794 and 0.345. The study showed a certain similarity between the chemical compositions in ethyl acetate parts with fingerprints characteristic peak. And the results may indicated high similarity among A. officinarum， A. galangal and A. katsumadai， while low similarity between Alpinia galanga and A. oxyphylla in fingerprints. The established HPLC fingerprint chromatogram of five traditional Chinese medicines was precise， reproducible and stable. In this study， the resulted also identified the nine common peaks， six strong peaks. The spectrum showed that A. officinarum and A. galangal share five common peaks； A. officinarum and A. galangal share three common peaks； A. galangal and A. galanga share two common peaks； A. officinarum and A. oxyphylla share three common peaks. The results showed that the method was stable， timesaving and reliable. The original chemical compositions have a certain correlation between traditional Chinese medicines （TCM）. This study provides the information for exploring the relevance on genetic relationship of TCM and chemical compositions in Alpinia.

Key words： Alpinia Roxb， traditional Chinese medicine， ethyl acetate parts， HPLC， fingerprint， determination

高良姜（AIpinia officinarum）、大高良姜（A. galangal）、紅豆蔻（A. galanga）、草豆蔻（A. katsumadai）、益智（A. oxyphylla）都是姜科山姜屬（Alpinia L.）中藥，具有相同的基原，《中華本草》皆有收載（《中華本草》，1999），其中高良姜、紅豆蔻、草豆蔻、益智也載于《中國藥典》（《中華人民共和國藥典》，2015）。這些藥物具有相似的藥性、功效，性味辛溫（熱），主歸脾胃經(jīng)，具有溫中散寒等功效，臨床常用于治療脾胃寒證（陳艷芬等，2014；畢培曦等，1987；馬平等，2015；袁媛等，2016）。

中藥親緣關(guān)系相同或相近的藥物一般具有相同或相似的化學(xué)成分，這些化學(xué)成分可能是支撐其藥性與功效的物質(zhì)基礎(chǔ)（賴新梅等，2009）。山姜屬中藥是有著重要的臨床應(yīng)用價值的中藥，在藥性和功效方面共性明顯，本研究選擇此為研究對象，是為了了解其親緣關(guān)系、化學(xué)成分-藥性-效用的相關(guān)性，探知中藥藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，闡釋中藥藥性理論與功效的科學(xué)內(nèi)涵。筆者對這5味山姜屬中藥的乙酸乙酯部位進(jìn)行了高效液相（HPLC）指紋圖譜研究?，F(xiàn)作一報道。

1儀器、試劑與藥材

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD檢測器G1315D，在線脫氣裝置，高壓四元泵G1311C，標(biāo)準(zhǔn)自動進(jìn)樣器G1329B，智能化柱溫箱G1316A，Agilent Chemistation色譜工作站 （Agilent科技有限公司）；美國Millipore密理博明澈TMD超純水系統(tǒng)；BP211D萬分之一克電子天平 （德國賽多利斯生產(chǎn)）；SAITEXIANGYI.PGL16冷凍離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)公司）；HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋 （國華電器有限公司）；SB2512D型超聲清洗儀 （寧波新芝生物科技公司）。

1.2 試劑

乙腈、甲醇為色譜純 （賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)）；磷酸為優(yōu)級純 （成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)）；水為超純水 （MilliQ Synthesis 超純水系統(tǒng)，電阻率≥18.2M cm，TOC < 4 ppb）；甲醇、乙醇、石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇均為分析純。

1.3 藥材

高良姜、大高良姜、紅豆蔻、草豆蔻、益智均購于南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司。高良姜、大高良姜批號：130601；草豆蔻、益智批號：130801；紅豆蔻批號：130901；益智產(chǎn)地海南，其余四藥產(chǎn)地皆為廣西。以上藥材經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室田慧教授鑒定均為《中華本草》收載的相應(yīng)品種。

2方法

2.1 供試品溶液的制備

稱取藥材粗粉各200 g，加8倍量80%乙醇回流提取3次，每次2 h。藥液過濾，合并3次濾液，回收乙醇，母液備用。取一部分母液濃縮、干燥，制成浸膏A，作為各藥材的醇提物，用于后期進(jìn)行各藥材乙醇部位的實驗研究。剩余母液分別用石油醚、乙酸乙酯及水飽和正丁醇萃取3次（每次溶劑用量與母液的比例為1∶1），分別回收相應(yīng)萃取液，濃縮、干燥，得高良姜、大高良姜、紅豆蔻、草豆蔻、益智5味藥的石油醚提取物B，其重量分別為5.12、3.16、0.54、5.98、5.28 g；乙酸乙酯提取物C，其重量分別為5.08、10.5、12.48、5.12、6.24 g；正丁醇提取物D，其重量分別為4.3、6.82、6.32、16.36、16.24 g；以及剩余殘渣E，其重量分別為9.5、2.88、2.08、4.24、4.26 g。取乙酸乙酯提取物50 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲處理15 min，放冷，搖勻。取供試品溶液適量，離心后取上清液，用0.22 μm濾膜濾過，即得（陳華國等，2010）

2.2 HPLC色譜條件

色譜柱：phenomenexC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水溶液（B），梯度洗脫（0→10→25→30→40→60 min，A 的體積百分?jǐn)?shù)為 20%→40%→45%→60%→70%→100%）；流速：1.0 mL·min1；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 方法學(xué)考察以及HPLC指紋圖譜實驗

精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、重復(fù)性實驗參照王麗峰等（2008）、宋桂萍等（2013）和劉鄂湖等（2008）的方法。

3結(jié)果與分析

3.1 精密度實驗

取同一個供試品溶液，按2.2項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10 μL，記錄HPLC色譜圖，選擇出峰時間適中，分離效果好，且峰形較好的峰為內(nèi)參照峰，計算各色譜峰相對保留時間的RSD值和相對峰面積的RSD值，結(jié)果顯示，各色譜峰相對保留時間的RSD值為0.01%～0.09%，相對峰面積的RSD值為0.46%～2.96%。這表明儀器的精密度良好。

3.2 穩(wěn)定性實驗

取新制備的供試品溶液，分別考察0、2、4、6、12、24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，計算各色譜峰相對保留時間的RSD值和相對峰面積的RSD值。計算結(jié)果顯示24 h內(nèi)同一份供試品溶液中各色譜峰相對保留時間的RSD值為0.028%～0.15%，相對峰面積的RSD值為0.24%～2.62%。這表明樣品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

3.3 重復(fù)性實驗

取同一批號的樣品6份，各取供試品溶液10 μL，按照2.1項下方法制備并進(jìn)樣檢測分析，結(jié)果6份樣品中各色譜峰相對保留時間的RSD值為0.055%～0.39%，相對峰面積的RSD值為0.07%～1.67%。這表明方法的重復(fù)性良好。

3.4 HPLC指紋圖譜實驗

3.4.1 HPLC指紋圖譜分析取5味山姜屬中藥乙酸乙酯部位的供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，按2.2項下色譜條件進(jìn)行測定，得到5味山姜屬中藥乙酸乙酯部位的HPLC色譜圖（圖1）。采用國家藥典委員會相似度評價系統(tǒng)對各HPLC色譜圖進(jìn)行評價，生成對照HPLC指紋圖譜，根據(jù)以上供試品的檢測結(jié)果，對各色譜峰進(jìn)行峰匹配，計算相似度。結(jié)果見圖2和圖3。

3.4.2 HPLC指紋圖譜相似性分析采用國家藥典委員會頒布的中藥指紋圖譜相似度評價軟件對各HPLC色譜圖進(jìn)行峰匹配，根據(jù)相對保留時間對5味山姜屬中藥乙酸乙酯提取部位的共有指紋峰進(jìn)行標(biāo)定，確定有27個主要共有峰，以峰面積最大的9號峰作為參照峰，設(shè)參照峰的保留時間和峰面積均為1，計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果見表1和表2。

通過分析比較發(fā)現(xiàn)：5味山姜屬中藥乙酸乙酯部位的共有峰中，高良姜、大高良姜含有5個共有峰，即峰9、16、17、18和26；高良姜和草豆蔻含有3個共有峰，為峰13、24和26；大高良姜和紅豆蔻含有2個共有峰，為峰19和20；高良姜和益智含有3個共有峰，為峰18、19和21。采用中藥指紋圖譜相似度評價軟件進(jìn)行計算， 5味山姜屬中藥乙酸乙酯部位化學(xué)成分相似度見表3。

4討論與結(jié)論

4.1 色譜條件篩選討論

選用三種不同型號的色譜柱對同一供試品溶圖 15味山姜屬中藥乙酸乙酯部位HPLC色譜圖 A. 高良姜； B. 大高良姜； C. 紅豆蔻； D. 草豆蔻； E. 益智。

液進(jìn)樣分析，結(jié)果表明選用phenomenexC18色譜柱分離度較好。在流動相系統(tǒng)選定中，使用多種流動相系統(tǒng)試驗，以采用乙腈-水系統(tǒng)色譜峰的分離度和峰形最好。等梯度洗脫時， 改變流動相的比例或者組成只能得到較少的色譜峰，故改成梯度洗脫方式。在考察指紋圖譜條件的過程中，采用二極管陣列檢測器，通過全波長掃描比較不同波長下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)260 nm的吸收強(qiáng)度最大，出峰最多，且峰形較好，所以選擇260 nm作為檢測波長。在流速的考察上，流速0.8、1.0、1.2 mL·min1對色譜分離效果的影響，色譜峰出峰情況相似，因此選擇更容易配制并且濃度稍大的流速1.0 mL·min1。三種柱溫25、30、35 ℃對色譜分離效果的影響，色譜峰出峰情況相似，因此選擇溫度更容易控制的30 ℃。本研究在藥材的提取方法、提取溶劑、提取時間和樣品處理方法上經(jīng)過了大量的預(yù)實驗來進(jìn)行優(yōu)化，所建立的方法在精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性方面完全符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求（馬珠鳳和張萬峰，2006）。

4.2 5味山姜屬中藥指紋圖譜討論

本研究對高良姜、大高良姜、紅豆蔻、草豆蔻、益智5味山姜屬中藥的乙酸乙酯部位進(jìn)行成分分析，共標(biāo)定了9個共有峰，建立6個強(qiáng)峰，其中6強(qiáng)峰表示這5味山姜屬中藥中的主要成分及其含量。并且采用相似度評價軟件進(jìn)行檢測，5味山姜屬中藥的乙酸乙酯部位化學(xué)成分有一定的相似性，其中，高良姜、大高良姜、草豆蔻的相似性較大，紅豆蔻和益智的相似性較小。指紋圖譜相似度評價方法是國家公認(rèn)的判定中藥化學(xué)成分相似性的一種方法。其理論認(rèn)為，指紋圖譜相似度高的藥物，化學(xué)成分相似， 其藥效也相似 （王璽等，2003）。本研

究結(jié)果顯示，同基原的中藥，化學(xué)成分均有一定的相似性，但程度不同；有的化學(xué)成分相似度很高，有的偏低。這說明藥用植物的親緣關(guān)系與化學(xué)成分存在相關(guān)性，有的密切相關(guān)，有的部分相關(guān)。

本研究結(jié)果對促進(jìn)中藥理論學(xué)術(shù)發(fā)展有深遠(yuǎn)的意義，對綜合利用藥用植物和擴(kuò)大藥源以及開發(fā)新藥都具有參考價值，而且還為后續(xù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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