摘要： 艷山姜為姜科山姜屬植物，艷山姜（Alpinia zerumbet）的干燥成熟果實，是貴州少數(shù)民族地區(qū)的傳統(tǒng)習用藥物，艷山姜在貴州省的種植面積已超過130 hm2，是貴州“南藥”的第一大宗產品，也是治理石漠化的重要經濟植物，其自然資源非常豐富，亦是民間常用的香料植物資源。該研究采用性狀、顯微及理化鑒定方法，對艷山姜果實進行了系統(tǒng)的生藥學研究，并對α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇四個主要心血管藥理活性成分進行含量分析。結果表明：艷山姜果實性狀鑒別特征為果皮見12～20條縱棱隆起，頂端具花被殘基突起，種子團由白色隔膜分為3瓣，每瓣具種子8～20粒不等，較易散落。顯微鑒別特征為：種子橫切面具1～2列油細胞，外胚乳細胞含淀粉粒，并可見細小草酸鈣方晶；果實粉末可見螺紋導管、草酸鈣方晶、淀粉粒、石細胞等。氣相色譜法測得艷山姜果實揮發(fā)油中α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇的平均含量分別為4.292%、3.966%、9.703%、27.171%。該研究的性狀、顯微鑒別方法準確、簡單、易行，可作為艷山姜藥材的鑒別依據(jù)；氣相色譜含量測定方法重現(xiàn)性好，測定結果精確可靠，可用于艷山姜果實揮發(fā)油的含量測定。 該研究結果為艷山姜藥材的鑒定及進一步開發(fā)利用提供科學參考。

關鍵詞： 艷山姜， 性狀鑒別， 顯微鑒別， 氣相色譜法， 含量測定

中圖分類號： R282.5文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）08104306

Abstract： Alpiniae zerumbe was a traditional medicinal medicine in Guizhou minority areas，which was the first large product of Guizhou “Southern Medicine”， and also an important economic plant for controlling rocky desertification. The natural resources of A. zerumbe were very rich， and as a common spice plant resource， but has not yet seen the research report about pharmacognosy on A. zerumbe. The systematic study on the pharmacognosy and the determination of content by GC of the national medicine fructus of A. zerumbe. The results showed that the peel had 12-20 longitudinal ridge uplift，and a perianth protrusions with the top of fructus. The seed was divided into three petals from the white septum， and each petal with 8-20 seeds which easy to scattered. The microscopic identification results were as follows： seed crosssection containing 1-2 oil cells， endosperm cells containing starch granules， and a small amount of fine calcium oxalate crystal. There were thread duct， calcium oxalate crystal， starch granules， sclereid and so on which in the powder of A. zerumbe. And the average contents of αpinene， camphene， βpinene and 1，8eucalyptol were 4.292%， 3.966%， 9.703% and 27.171% determined by GC. The character and microscopic identification method of this experiment were accurate， simple and easy to use， which can be used as the basis for the identification of the fructus of A. zerumbe. The method of determination of GC content was good reproducibility and the result was accurate and reliable， and could be used for the determination of volatile oil of fructus of A. zerumbe.

Key words： Alpinia zerumbet， character identification， microscopic identification， GC， content determination

艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜（Alpinia zerumbet）的干燥成熟果實，始見于《植物名實圖考》，是貴州少數(shù)民族地區(qū)的傳統(tǒng)習用藥物。具有溫中燥濕、行氣止痛、截虐之功效，主治心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥狀，已收錄于2003版《貴州省中藥、民族藥質量標準》中（貴州省藥品監(jiān)督管理局，2003）。艷山姜廣泛分布于我國東南部至西南部各地，20世紀80年代末至90年代初，艷山姜在貴州黔西南地區(qū)開始大面積種植栽培，目前在貴州種植面積超過130 hm2，年產量在50 t以上，是貴州“南藥”第一大宗產品，也是治理石漠化的重要經濟植物。艷山姜果實主要含揮發(fā)油類、黃酮類、二萜類及有機酸類等化合物，其中揮發(fā)油為主要活性部位（張彥燕等，2010）。本課題組前期通過GCMS從艷山姜果實揮發(fā)油中分離鑒定出83個化學成分，主要以萜烯類化合物為主，分別含有烯、醇、酮、酯、醚、烷類化合物（陶玲等，2009）。另有采用HPLC測定艷山姜中去甲氧基醉椒素（李莉等，2013）及GC法測定桉油精的含量（黃家宇等，2014）。Lahlou et al（2003）發(fā)現(xiàn)艷山姜葉揮發(fā)油成分松油烯4醇具有直接的血管松弛作用，且不依賴于交感神經系統(tǒng)，而依據(jù)貴州民族地區(qū)習用艷山姜藥材多為果實的特點，近年來本實驗室開展了艷山姜果實揮發(fā)油的心血管藥理學活性研究工作，結果證實其主要通過調控血管內皮功能穩(wěn)態(tài)發(fā)揮保護作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，艷山姜對脂多糖（LPS）誘導損傷的內皮細胞具有保護作用，及對自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈血管纖維化重構具有抑制作用，其作用機制均與抑制核因子NFκB的激活有關；通過正交試驗設計法進一步證實α蒎烯、莰烯、1，8桉葉油醇及β蒎烯為艷山姜果實揮發(fā)油中的主要活性物質基礎（張彥燕等，2014；LingHu et al，2016）。

生藥學（Pharmakognosie，Pharmacognosy）是應用本草學、植物學、動物學、化學（包括植物化學、藥物分析化學、生物化學等）、藥理學、中醫(yī)學、臨床醫(yī)學和分子生物學等學科的理論和知識，運用現(xiàn)代科學技術來研究生藥的基源、鑒定、有效成分、生產、采制、品質評價及資源可持續(xù)性開發(fā)利用等的一門學科（蔡少青等，2016）。艷山姜藥材自然資源非常豐富，亦是民間常用的香料植物資源，目前尚未見關于艷山姜藥材生藥學方面的研究報道。因此，基于上述因素，結合其巨大的市場需求，本研究采取性狀、顯微及理化鑒定方法，對艷山姜果實進行了系統(tǒng)的生藥學研究，并對α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇四個主要心血管藥理活性成分進行含量分析，旨在為艷山姜藥材的鑒定及進一步開發(fā)利用提供科學參考。

1材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

GC14B氣相色譜儀（日本島津公司），BS223S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），ZNHWII型加熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司），Nikon NiU顯微鏡一套（日本尼康公司）。α蒎烯，β蒎烯，1，8桉葉油醇及莰烯對照品（ 阿拉丁公司，批號分別為P110875（純度98%），P108923（純度98%），E111234（純度99.5%），C107295（純度95%），其余試劑均為分析純。艷山姜于2016年8月采自貴州省黔西南州貞豐縣連環(huán)鄉(xiāng)巧巖村（批號：20160811、20160816、20160820），經貴州醫(yī)科大學龍慶德副教授鑒定為姜科山姜屬植物艷山姜（Alpinia zerumbet）的干燥成熟果實。

1.2 方法

1.2.1 性狀鑒別采用形態(tài)鑒別法觀察艷山姜果實的形狀、大小、顏色、氣味、表面特征及質地等外觀性狀。

1.2.2 顯微鑒別取艷山姜種子制作石蠟切片，顯微鏡下觀察其組織特征；艷山姜果實于60 ℃烘干，粉碎后過80目篩，制備臨時粉末制片，顯微鏡下觀察組織特征。

1.2.3 GC含量測定

1.2.3.1 色譜條件采用SE54毛細管色譜柱（0.5 μm，30 m × 0.53 mm）；載氣為高純氮氣，流量20 mL·min1；柱前壓力：氫氣 50 kPa， 空氣 50 kPa；程序升溫：初始溫度35 ℃，以5 ℃·min1升溫至50 ℃后，保持2 min，以5 ℃·min1升溫至120 ℃，保持2 min，以6 ℃·min1升溫至260 ℃；運行時間：42 min；氣化室、檢測室溫度均 265 ℃；進樣量1 μL。

1.2.3.2 對照品溶液的制備分別取α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，分別得0.67、0.44、0.86、0.87 mg·mL1對照品溶液，按照1∶1∶1∶1比例混合，得4個對照品混合溶液，-20 ℃冰箱儲存，備用。

1.2.3.3 供試品溶液的制備將艷山姜干燥果實破碎至種子破裂，按藥典要求均勻取樣，精密稱取120 g，加12倍蒸餾水浸泡1 h，按2015年版《中國藥典》（四部）通則2204揮發(fā)油測定法（國家藥典委員會，2015）提取5 h，收集揮發(fā)油，經無水硫酸鈉干燥后，加適量乙酸乙酯配成1 g·L1樣品溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，-20 ℃冰箱儲存。

1.2.3.4 線性關系的考察精密量取混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置 10 mL 量瓶中，用乙酸乙酯定容。精密量取1 μL進樣，按“1.2.3.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，測定峰面積。

1.2.3.5 精密度試驗精密吸取混合對照品溶液1 μL，按“1.2.3.1” 項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次。

1.2.3.6 重復性試驗取同一樣品6份，按“1.2.3.3” 項下方法制備供試品溶液， 并按“1.2.3.1” 項下色譜條件測定。

1.2.3.7 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、12、24 h 精密量取1 μL 進樣，按“1.2.3.1” 項下色譜條件測定。

1.2.3.8 加樣回收試驗精密稱定已知含量的艷山姜藥材6份，分別精密加入α蒎烯，β蒎烯，1，8桉葉油醇及莰烯對照品適量，按“1.2.3.3” 項下方法制備供試品溶液，按“1.2.3.1” 項下色譜條件測定。

2結果與分析

2.1 性狀鑒別

藥材果實呈橢圓形或不規(guī)則球形，兩端略尖，長2.1～3.5 cm，直徑1.4～2.1 cm，表面棕黃色，有12～20 條縱棱隆起，頂端具一花被殘基突起，基部具果柄斷痕。果皮薄而脆。種子集結成團，具三鈍棱，排列較疏松，具白色隔膜，將種子團分成3瓣，每瓣有種子8～20 粒，易散落。種子為不規(guī)則多面體，長0.3～0.6 cm，直徑 0.2～0.5 cm（圖1）。氣芳香，味辛涼、微苦。

2.2 顯微鑒別

2.2.1 種子橫切面最外層為假種皮，有時殘存。種皮表皮細胞1列，表觀長條形，與下皮細胞垂直排列，徑向延長，為淡黃色。下皮細胞1～2列，長方形或類圓形，切向排列，壁厚，內含紅棕色或棕色物質。油細胞層為1～2 列油細胞，含黃色油滴。色素層為2～6列棕色細胞，散有類圓形油滴；內種皮為 1 列柵狀厚壁細胞，內壁及側壁極厚，胞腔小，內含硅質塊。外胚乳細胞含淀粉粒，并有少數(shù)細小草酸鈣方晶。內胚乳細胞含散在細小脂肪油滴（圖2）。

2.2.2 粉末鑒別 灰黃色。內種皮厚壁細胞為紅棕色或黃棕色，表面觀為多角形，胞腔內含硅質塊。外胚乳細胞多為類圓形或不規(guī)則形，長7～15 μm，充滿細小淀粉粒集結成的淀粉團。油細胞較大，卵圓形或類圓形，長12.65～35.84 μm，含棕色物。石細胞呈多角狀或類圓形，壁厚，長8.41～24.56 μm。淀粉粒眾多，多為單粒，呈類圓形或不規(guī)則形，臍點為點狀、一字形或人字形，直徑4.72～21.12 μm，少為復粒，常由 2～3 個分粒組成；草酸鈣方晶散在，大小懸殊，長6. 21～13. 32 μm，寬5. 98～12.53 μm?？梢娐菁y導管，直徑6.92～21.25 μm。韌皮纖維壁木化，直徑18～35 μm，壁厚4～7 μm（圖3）。

2.2.3 線性關系的考察以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程： Yα-蒎烯= 217.45X + 5.496 （r=0.999 8），Y莰烯= 165.37X + 6.49 （r=0.999 7），Yβ-蒎烯 = 246.87X + 7.513 （r=0.999 8），Y1，8-桉葉油醇= 269.63X + 3.28 （r=0.999 9） ，α-蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇進樣量分別在3.36～42.1 μg、2.20～27.56 μg、4.32～54.01 μg、4.36～54.50 μg與峰面積的線性關系良好。

2.2.4精密度試驗α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇峰面積的RSD分別為2.31%、1.97%、2.45%、2.40%，表明儀器精密度良好。

2.2.5重復性試驗α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇的含量的RSD分別為0.56%、1.23%、1.70%、2.12%，表明方法重復性良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇的含量的RSD分別為1.98%、2.05%、0.71%、2.23%，說明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收試驗α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1， 8桉葉油醇的平均加樣回收率，分別為100.94%、圖 4混合對照品（A）與艷山姜藥材（B）的GC色譜圖1. α蒎烯； 2. 莰烯； 3. β蒎烯； 4. 1，8桉葉油醇。

Fig. 4GC chromatogram of mixed reference substances （A） and Alpiniae zerumbe （B）

1. αpinene； 2. camphene； 3. βpinene； 4. 1，8eucalyptol.

3討論與結論

生藥學的主要研究任務為在個體和種群等較宏觀水平開展生藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的鑒別和質量評價，為生藥資源生產及可持續(xù)利用提供依據(jù)。艷山姜作為貴州地產特色民族藥材，傳統(tǒng)藥用部位為其干燥成熟果實，本研究通過性狀、顯微鑒別，證實艷山姜鑒別特征為果皮薄而脆，表面有數(shù)條縱棱隆起，內種皮為1列柵狀厚壁細胞，外胚乳細胞充滿細小淀粉粒集結成的淀粉團。油細胞較大，含棕色物，韌皮纖維壁木化。此外螺紋導管、草酸鈣方晶、淀粉粒、石細胞也是重要鑒別特征。藥材的性狀、顯微鑒別是生藥學研究的重要組成部分，通過從外觀性狀到內部結構的鑒定，完善了藥材的品質評價與質量控制。

本研究通過GC法測定艷山姜中α蒎烯，β蒎烯，1，8桉葉油醇及莰烯四個活性成分的含量，結果表明4個活性成分的平均含量分別為4.292%、9.703%、27.171%、3.966%。沈祥春等（2010）研究艷山姜果實α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇含量分別為9.275%、10.120%、5.056%、10.956%；陶玲等（2009）研究中α蒎烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇三個活性成分，含量依次為5.826%、7.850%、9.172%，未見莰烯成分鑒定及分析。李莉等（2013）采用HPLC法測定了貴州3個不同產地艷山姜藥材中具有拮抗實驗性胃及十二指腸潰瘍的成分去甲氧基醉椒素的含量，結果不同產地艷山姜藥材中醉椒素含量存在差異，黃家宇等（2014）運用GC法測定了艷山姜揮發(fā)油中桉油精（1，8桉葉油醇）的含量。本文選用經典、簡便易行的GC法，測定了艷山姜揮發(fā)油中的心血管活性組分，并進行了色譜條件的方法學考察和驗證，且對檢測方法及條件的重復性、樣品的穩(wěn)定性及儀器的精密性進行了考察說明，所采用的測定方法結果可靠，且簡便易行。

隨著中藥學研究的發(fā)展，基于藥效復雜體系的中藥多成分、多靶點的作用特點已日趨成為國內外廣大學者的研究熱點。中藥所含化學成分是其藥效作用的物質基礎，因而基于藥效的特定化學成分分析及對效應物質群的全面分析與評價，對中藥質量標準及控制具有重要意義。本文測定α蒎烯、莰烯、β蒎烯及1，8桉葉油醇，均為艷山姜果實揮發(fā)油中主要活性組分，4 個組分既能提高內皮細胞活力，還能調控改善血管內皮的功能穩(wěn)態(tài)，突出體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分、多靶點綜合療效的特點。本研究對于艷山姜藥材質量分析方法簡便可行、準確度高、重現(xiàn)性好，適用于艷山姜藥材的鑒定及化學成分的分析研究，利于艷山姜貴州大宗藥材的質量控制及產業(yè)化發(fā)展。

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