摘要： 該研究以馬尾松三個不同改良水平的良種生產(chǎn)群體子代為材料，用天然群體作為對照，采用16對SSR引物對試驗群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，并探究遺傳改良對馬尾松林分遺傳多樣性的影響。結(jié)果表明：馬尾松天然群體、母樹林子代、1代種子園子代及1.5代種子園子代的Shannon多樣性指數(shù) （I） 分別為0.53、0.53、0.53、0.46；觀測雜合度 （Ho） 分別為0.36、0.36、0.39、0.35；期望雜合度 （He） 分別為0.32、0.32、0.33、0.27。在這三項主要遺傳多樣性指標(biāo)上，馬尾松母樹林、1代種子園及1.5代種子園的子代之間無顯著差異。由此說明，在廣西馬尾松的遺傳改良進(jìn)程中，遺傳多樣性并未因改良選擇而受到明顯的影響。良種人工林與天然林相比較，馬尾松良種人工林在三項主要指標(biāo)上無明顯下降，說明廣西三類主要的良種群體都具有較好的群體緩沖能力和個體緩沖能力。該研究結(jié)果對于科學(xué)制定馬尾松育種策略具有重要意義，為馬尾松高世代育種研究提供了重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 馬尾松， 改良水平， 生產(chǎn)群體， 遺傳多樣性 ， 種子園

中圖分類號： Q948文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 10003142（2017）08101906

Abstract： The effects of genetic improvement on the genetic diversity of Pinus massoniana forest were studied， by using three improved levels of progeny of seed production populations as the research material， and the natural population as the control. The genetic diversity of the experimental groups was analyzed by sixteen pairs of SSR primers. The results were as follows： Shannon’s information index （I） of natural populations， progeny of seed production area， offspring of Generation 1 seed orchard and Generation 1.5 seed orchard of P. massoniana were 0.53， 0.53， 0.53 and 0.46； observed heterozygosity （Ho） 0.36， 0.36， 0.39， 0.35 respectively； expected heterozygosity （He） 0.32， 0.32， 0.33， 0.27 respectively. There were no significant difference among the offsprings of seed production areas of Generation 1 and Generation 1.5 seed orchards of P. massoniana on the three main genetic diversity indexes. It showed that the genetic diversity of improved varieties was not affected significantly by the improved selection in the process of genetic improvement of P. massoniana in Guangxi. Compared with the plantations and natural forest， we knew that there was no significant decrease in the three main indexes of the improved varieties， which indicated that the three kinds of main populations in Guangxi had good group buffer capacity and individual buffer capacity. The results of the study have important significance for the scientific development of breeding strategy in P. massoniana， and provide important data support for the research of high generation breeding of P. massoniana.

Key words： Pinus massoniana， improved level， production populations， genetic diversity， seed orchard

隨著林木遺傳改良研究進(jìn)程不斷深入，經(jīng)過遺傳品質(zhì)改良的種苗被越來越多應(yīng)用于人工林營建。而對林木遺傳品質(zhì)進(jìn)行人為控制，在提高森林經(jīng)濟(jì)效益的同時也將導(dǎo)致“野生”種群逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椤叭斯じ牧肌狈N群。在這一改良過程中，通過選育淘汰很大比例的原始群體，最終形成用于繁育良種的生產(chǎn)群體。人工造林“新種群”的遺傳多樣性受制于生產(chǎn)群體的有效大小，其遺傳基礎(chǔ)常常被限制在很窄的范圍內(nèi)，從而引起多樣性的流失，導(dǎo)致有利基因或基因綜合體的丟失，種群對自然環(huán)境的適應(yīng)性和抗性變?nèi)酰ㄖ齑蟊＃?994）。而林木遺傳改良的理想狀態(tài)是改良過程中既能夠獲得較高的遺傳增益，又能保持較高的遺傳多樣性。一方面為林木可持續(xù)改良提供基礎(chǔ)，另一方面為林木生產(chǎn)提供雜合度較高、適應(yīng)性和穩(wěn)定性較強(qiáng)的良種。因此，對不同改良水平的生產(chǎn)群體子代開展遺傳多樣性研究，對于制定科學(xué)合理的育種策略具有重要意義。

馬尾松（Pinus massoniana）是我國分布最廣的針葉樹種，在我國約1/5國土范圍內(nèi)的山地均有分布；也是我國南方地區(qū)重要的用材、工業(yè)原料和荒山造林樹種，其木材和松脂是許多森林工業(yè)、林產(chǎn)和造紙工業(yè)的支柱（周正賢，2001）。我國馬尾松遺傳改良研究開始于20世紀(jì)50年代（余新妥，1959），首先是對馬尾松天然林林分、種源水平和母樹林進(jìn)行研究，進(jìn)而選擇并收集大量優(yōu)樹，營建馬尾松初級種子園和1.5代種子園（楊章旗，1994）。廣西是馬尾松主要分布區(qū)，也是主要的栽培區(qū)，擁有面積廣闊的馬尾松人工林。廣西馬尾松第一代改良選擇獲得了約32%材積增益。在廣西馬尾松遺傳改良過程中，母樹林、1代種子園與1.5代種子園先后成為良種生產(chǎn)的主要來源，其遺傳多樣性大小直接影響到馬尾松人工林的遺傳豐富度。因此，本研究以SSR分子標(biāo)記為技術(shù)手段對三種生產(chǎn)群體的子代進(jìn)行對比分析研究，以此來分析改良選擇對子代良種遺傳多樣性的實際影響，為馬尾松高世代育種研究提供重要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

馬尾松不同改良水平子代測定試驗林位于廣西國有拉浪林場。林場位于宜州市西北部，地理位置為24°34′49.1″ N， 108°16′45.1″ E。地處桂北低山丘陵區(qū)，海拔175 m，相對高差較小，坡度多在30°以下。為亞熱帶季風(fēng)性氣候，年平均氣溫在19.6～20.8 ℃，極端最高氣溫39.8 ℃，極端最低氣溫-2.2 ℃；年降水量在1 500 mm以上，年平均氣溫15.7 ℃。氣候溫暖，雨量充沛，年平均日照時數(shù)1 695.7 h，年均降雨量1 304.1 mm。土壤為紅壤。

試驗林于2011年4月造林，共有37個半同胞家系參加試驗，親本分別來自歐洞林場馬尾松古蓬種源人工母樹林、南寧市林科所1代種子園、歐洞林場1.5代種子園及1988年南寧市林科所營建的子代測定林優(yōu)樹。試驗設(shè)計為9株小區(qū)，4次重復(fù)。2013年9月，選擇A、B、C 3個親本在母樹林產(chǎn)生的半同胞家系A(chǔ)1、B1、C1，在初級種子園產(chǎn)生的半同胞家系A(chǔ)2、B2、C2，及1.5代種子園產(chǎn)生的半同胞家系A(chǔ)3、B3、C3（母樹林親本為母株，初級種子園及1.5代種子園親本為嫁接得到的無性系分株）。每個家系采集30個單株的新鮮針葉（若不足30株，則全部取樣），冷凍保存。具體見表1。

以馬尾松古蓬種源天然群體樣本作為對照。樣本采自廣西忻城縣古蓬鎮(zhèn)。采樣點坐標(biāo)范圍在108°34′51.86″～108°37′48.85″ E、23°44′47.90″～23°49′24.13″ N之間，海拔138～291 m，林齡15～30 a，平均樹高22.0 m，平均胸徑34.3 cm。采樣單株間距50 m以上。共采集52個單株的新鮮針葉采用硅膠干燥保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取使用CTAB裂解—硅珠吸附法提取馬尾松針葉DNA（Doyle JJ Doyle JL，1990），保存于4 ℃冰箱。

1.2.2 引物來源及SSRPCR反應(yīng)條件所使用的SSR 引物根據(jù)馬尾松基因組DNA 序列設(shè)計開發(fā)，共計506對（Feng et al，2013）。篩選出16對多態(tài)性高的SSR引物用于遺傳多樣性分析。Taq酶、dNTPs等購自捷瑞生物工程公司，引物合成也由該公司完成。具體PCR體系和擴(kuò)增程序參照Feng et al（2013）進(jìn)行。將得到擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，實驗參照楊章旗等（2014）的方法進(jìn)行。

1.2.3 遺傳多樣性分析SSR為共顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性。采用凝膠成像系統(tǒng)，對所得的圖片進(jìn)行判讀，然后根據(jù)所讀的數(shù)據(jù)用A， B， C， D，E，…，按條帶長度大小，從大到小進(jìn)行編號。

采用POPGENE32軟件（Yeh et al，1997）計算下列遺傳參數(shù)：（1）多態(tài)位點百分率（Percentage of polymorphic loci，PPB）；（2）觀測等位基因數(shù)目（Observed number of alleles，Na）；（3）有效等位基因數(shù)目 （Effective number of alleles，Ne） （Hartl et al，1989）；（4）Shannon’s多樣性指數(shù)（Shannon’s information index， I）（Shannon Weaver，1949）；（5）觀測雜合度（Observed heterozygosity，Ho）；（6）期望雜合度（Expected heterozygosity，He） （Nei et al，1973）。2結(jié)果與分析

2.1 試驗群體總體遺傳多樣性

16對 SSR 引物在9個家系的251 個樣本中共檢測到45個等位基因，多態(tài)位點百分率為100%。每個位點觀測等位基因數(shù)（Na）為2～5個，平均為2.81；有效等位基因數(shù)（Ne）為1.003～2.557，平均有效等位基因數(shù) 1.57。

不同位點的多樣性參數(shù)差別很大， Shannon 多樣性指數(shù)（I）最高為0.999，最低為 0.012，平均為 0.52。觀測雜合度（Ho）變化范圍為 0.003～0.916，平均為 0.35；期望雜合度（He）變化范圍為 0.003～0.610，平均為 0.31（表2）。

2.3 不同改良水平子代間遺傳多樣性差異分析

采用SAS8.1軟件根據(jù)多元方差分析模型對不同改良水平間家系遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，五項遺傳多樣性參數(shù)在不同改良水平子代間均差異不顯著（表4）。16對SSR引物在母樹林子代家系和1.5代種子園子代家系中均擴(kuò)增到了42個等位基因，而在初級種子園子代家系中擴(kuò)增到了41個等位基因。

2.4 馬尾松良種人工林與天然林遺傳多樣性比較分析

通過對馬尾松古蓬種源天然群體樣本的遺傳多樣性分析表明， 該群體平均等位基因數(shù) （Na） 為2.50；平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.60；Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.53；觀測雜合度（Ho）為0.36；期望雜合度（He）為0.32（表5）。

在Shannon多樣性指數(shù)（I）、觀測雜合度（Ho）

和期望雜合度（He）這3項重要的遺傳多樣性參數(shù)上與母樹林子代持平，低于1代種子園子代，但高于1.5代種子園子代，也略高于3類馬尾松良種人工林的平均水平（圖1）。

3討論與結(jié)論

育種群體的遺傳多樣性對多世代可持續(xù)改良意義重大。育種群體內(nèi)遺傳變異不斷損失，將導(dǎo)致該樹種失去持續(xù)改良的潛力（徐清乾等，2002）。林木的群體遺傳結(jié)構(gòu)在兩個水平上影響該群體適應(yīng)性和穩(wěn)定性，一是群體內(nèi)的總遺傳多樣性大小可以影響群體對外界環(huán)境緩沖能力；二是個體的雜合性可以影響樹木個體對異質(zhì)環(huán)境的緩沖能力。群體遺傳多樣性水平越高，則對異質(zhì)環(huán)境的適應(yīng)性就越強(qiáng)，林木群體也相對最穩(wěn)定（Wicks et al，2005）。正常條件下，自然分布狀態(tài)的林木群體的多樣性最豐富，水平也最高（Fogal et al，2002）。如果在改良過程因人為選擇使育種群體遺傳多樣性下降、基因型窄化時，其產(chǎn)生的人工種群的整體防護(hù)功能將降低。較為單一的基因型對環(huán)境變化的反應(yīng)相近似，此時人工種群的穩(wěn)定性主要靠個體自身來保證。同時基因型窄化又提高了發(fā)生近交的概率，有可能導(dǎo)致過于純化的人工種群在某些環(huán)境劇變中發(fā)生嚴(yán)重?fù)p失甚至被淘汰。因此，保持高水平遺傳多樣性是林木群體穩(wěn)定、生態(tài)發(fā)展的基礎(chǔ)和必要條件（Mahoney et al，2005；陳天華，1994）。

本研究中重點比較了可以代表群體遺傳復(fù)雜程度的Shannon多樣性指數(shù)（I）和代表群體雜合度的觀測雜合度（Ho）與期望雜合度（He）。本研究發(fā)現(xiàn)在這3項主要指標(biāo)上，馬尾松母樹林、1代種子園及1.5代種子園的子代間沒有顯著差異。由此說明，在廣西馬尾松的遺傳改良過程中，良種子代的遺傳多樣性并未因改良選擇受到明顯的影響。將良種人工林與天然林進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)馬尾松良種人工林在三項主要指標(biāo)上沒有明顯下降。說明廣西三類主要的良種群體都具有較好群體緩沖能力和個體緩沖能力。

在三個生產(chǎn)群體中，歐洞林場人工母樹林是由馬尾松古蓬種源的優(yōu)良林分經(jīng)疏伐改建而成的；南寧市林科所1代種子園的建園材料由來自廣西全區(qū)的464個優(yōu)樹無性系組成，其中包括了來自歐洞林場母樹林的部分優(yōu)樹無性系；而歐洞林場1.5代馬尾松種子園是在南寧市林科所1代種子園中選擇來自古蓬種源及其附近地區(qū)的50個優(yōu)樹無性系建立的。根據(jù)研究結(jié)果可以看出，母樹林子代可以很好地繼承親本群體的遺傳多樣性，在完成經(jīng)濟(jì)性狀初步改良的同時，較之天然林并未損失遺傳多樣性。第1代種子園的子代比母樹林子代和天然群體具有更高的遺傳多樣性，這表明基于廣泛的優(yōu)樹選擇建立的育種群體可以有效豐富良種子代的遺傳多樣性。從良種推廣角度來看，廣西馬尾松第一次改良獲得了較高的改良增益又提高了遺傳多樣性。1.5代種子園子代的遺傳多樣性最低，一方面緣于其親本群體的規(guī)模較小；另一方面可能因為其親本多來自同一種源，遺傳背景相似，二者共同導(dǎo)致1.5代種子園建園群體的遺傳基礎(chǔ)相對較窄，影響了子代的遺傳多樣性。因此，在制定1.5代生產(chǎn)群體的選擇策略時，在保證獲得足夠遺傳增益的同時，應(yīng)細(xì)致考慮入選材料遺傳背景、親緣關(guān)系及群體規(guī)模?？蓞⒖济绹鹁嫠膳c濕地松的育種策略，將整個育種群體分為主群體（main population）和精選群體（elite population）兩大部分。主群體各個亞系的成員按育種值高低分進(jìn)行排名，由高育種值的個體組成精選群體建立種子園（White et al，1993，2001）。

參考文獻(xiàn)：

CHEN TH， 1994. Protection of resources in the forest tree improvement [J]. J Fujian For Sci Technol， 21（3）：51-57. [陳天華， 1994. 林木改良中基因資源的保護(hù) [J]. 福建林業(yè)科技，21（3）：51-57. ]

DOYLE JJ， DOYLE JL， 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue [J]. FOCUS， 12：13-15.

FENG YH， YANG ZQ， WANG J， et al， 2013. Development and characterization of SSR markers from Pinus massoniana and their transferability to P. elliottii， P. caribaea and P. yunnanensis [J]. Genet Mol Res， 13（1）：1508-1513.

FOGAL WH， LAROCQUE GR， LOPUSHANSKI SM， 1999. Nutritional and sexual responses of jack pine toammonium nitrate and gibberellins [J]. For Sci， 45（1）：136-153.

HARTL DL， CLARK AG， 1989. Principles of population genetics [M]. 2nd ed. Sunderland： Sinauer Associates.

MAHONEY II， BERNSTEIN B， WOLFF J， 2005. FHWA’s maintenance decision support system project： Results and recommendations [J]. Transp Res Rec， 1911（1）：133-142.

NEI M， 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations [J]. Proc Nat Acad Sci Usa， 70：3321-3323.

SHANNON CE， WEAVER W， 1949. The mathematical theory of communication [M]. Urbana： University of Illinois Press.

WICKS J， TRELOAR SA， MARTIN NG， et al， 2005. New Concepts for distinguishing the hidden patterns of linkage disequilibrium which underlie association between genotypes and complex phenotypes [J]. Twin Res Human Gen， 8（2）：95-100.

WHITE TL， HODGE GR， POWELL GL， 1993. An advancedgeneration tree improvement plan for slash pine in the southeastern United States [J]. Silv Gen， 4（2）： 359-371.

WHITE TL， HUBER DA， POWELL GL， 2011. Thirdcycle breeding strategy for slash pine by the Cooperative Forest Genetics Research Program [M/OL]. Digital Library Okstate Edu.

XU QQ， XU ZK， CHENG ZH， et al， 2002. The building techniques on second grade seedgarden of Cunninghamia lanceolata [J]. Hunan For Sci Technol， 29（4）：16-19. [徐清乾，許忠坤，程政紅，等， 2002. 第二代杉木種子園建立技術(shù)研究 [J]. 湖南林業(yè)科技， 29（4）：16-19. ]

YANG ZQ， 1994. Genetic improvement process and future direction of Pinus massoniana in Guangxi [J]. Guangxi For Sci， 23（1）：41-45. [楊章旗， 1994. 廣西馬尾松遺傳改良進(jìn)程及未來發(fā)展方向 [J]. 廣西林業(yè)科學(xué)， 23（1）：41-45.]

YANG ZQ， FENG YH， WU DS， 2014. Analysis of genetic diversity of Pinus yunnanensis var. tenuifolia nature populations by SSR marker [J]. Guihaia， 34（1）：10-14. [楊章旗，馮源恒，吳東山， 2014. 細(xì)葉云南松天然種源林遺傳多樣性的SSR分析 [J]. 廣西植物， 34（1）：10-14. ]

YEH， FC， YangRC， BOYLE TB， et al， 1997. Popgene， the userfriendly shareware for population genetic analysis [M]. Canada： Molecular biology and biotechnology centre， University of Alberta.

YU XT， 1959. Geographic planting and germination test of Pinus massoniana [J]. Sci Silv Sin， （6）：452-461. [余新妥， 1959. 馬尾松的地理播種和發(fā)芽試驗 [J]. 林業(yè)科學(xué)，（6）：452-461.]

ZHOU ZX， 2001. Chinese Mason Pine [M]. Beijing：Chinese Forestry Press： 1-5. [周政賢， 2001. 中國馬尾松 [M]. 北京： 中國林業(yè)出版社： 1-5. ]

ZHU DB， 1994. Biodiversity and tree breeding [J]. Biodivers Sci， 2（3）：157-161. [朱大保， 1994. 生物多樣性與林木育種 [J]. 生物多樣性， 2（3）：157-161.]