摘要：膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)第二常見(jiàn)的腫瘤，也是引起泌尿系統(tǒng)腫瘤患者死亡的第二大腫瘤。DNA甲基化和組蛋白修飾是基因調(diào)控重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，二者之間單獨(dú)或相互作用在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。膀胱癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列表觀遺傳學(xué)改變影響諸多基因的表達(dá)和功能，如DNA高甲基化和組蛋白乙?；母淖儭１M管膀胱癌中表觀遺傳學(xué)改變的基因發(fā)現(xiàn)的越來(lái)越多，一些可能候選基因作為膀胱癌早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物的的篩選已經(jīng)有了一些令人期待的結(jié)果。然而異常表觀遺傳學(xué)改變的基因中具有膀胱癌敏感性和特異性仍需要進(jìn)一步的研究。本文擬就膀胱癌甲基化目前研究狀況及其在膀胱癌的診斷和治療中的前景做一簡(jiǎn)要介紹。

關(guān)鍵詞：膀胱癌；表觀遺傳學(xué)；甲基化；組蛋白修飾；腫瘤標(biāo)記物

膀胱癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是泌尿生殖系統(tǒng)第二常見(jiàn)的腫瘤，也是引起泌尿系統(tǒng)腫瘤患者死亡的第二大腫瘤[1，2]。基于其組織病理學(xué)表現(xiàn)和臨床行為，膀胱癌大體上可分為浸潤(rùn)性和非浸潤(rùn)性2類。經(jīng)非浸潤(rùn)性的膀胱癌占了總數(shù)的70%-80%，其中的70%左右的腫瘤會(huì)復(fù)發(fā)；在復(fù)發(fā)的腫瘤里面，10%-15%的腫瘤會(huì)發(fā)展成為浸潤(rùn)性或者伴有轉(zhuǎn)移的情況發(fā)生。而且20%的基層浸潤(rùn)性腫瘤進(jìn)展很快，預(yù)后很差[3]。準(zhǔn)確區(qū)分治療后有無(wú)復(fù)發(fā)和進(jìn)展情況的腫瘤非常重要，因?yàn)檫@些腫瘤形態(tài)上近似，而生物學(xué)行為卻大相徑庭。有一些基因被認(rèn)為與膀胱癌的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)[4，5]。基因芯片分析發(fā)現(xiàn)了這些基因在膀胱癌和正常粘膜組織中的表達(dá)差異[6]，然而這些基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控依然不明確，膀胱癌發(fā)展和惡化的分子生物學(xué)機(jī)制仍不為人所知[7]。不伴有DNA序列改變的遺傳學(xué)變異如突變、表觀遺傳學(xué)改變被認(rèn)為參與了膀胱癌的惡變和進(jìn)展。

表觀遺傳學(xué)改變的一種類型是DNA甲基化，是指在DNA分子CpG二核苷中的胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)，催化這一過(guò)程的是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中CpG二核苷酸出現(xiàn)頻率為5 %～10 %，約70%～80%的甲基化發(fā)生在CpG 序列上稱為甲基化的CpG二核苷酸（mCpG）。CpG二核苷在基因組中呈非隨機(jī)分布，某些富含CpG區(qū)域稱之為CpG島（CpG island），基因組中平均約100個(gè)bp有一個(gè)跨度為0. 5～5 Kb的CpG島。除了女性失活的X染色體和某種印記基因意外，CpG島通常是非甲基化的。DNA甲基化異常包括高甲基化和低甲基化兩種形式，均可導(dǎo)致染色體的不穩(wěn)定性和基因轉(zhuǎn)錄沉默，同時(shí)與人類腫瘤相關(guān)[8，9，10]。

另外一種表觀遺傳學(xué)異常的類型是組蛋白修飾，涉及到染色體的結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)的基本單位是核小體，它由DNA和組蛋白八聚體構(gòu)成，各兩分子的H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成八聚體的核心蛋白，DNA雙螺旋鏈編繞其上。組蛋白的N末端可進(jìn)行乙酰化、甲基化、泛素化等翻譯后修飾，這些修飾信息稱為組蛋白密碼。組蛋白乙?；l(fā)生在核心組蛋白N端的賴氨酸上，是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）催化，由乙酰輔酶A提供乙?；?。組蛋白去乙酰化由組蛋白去乙酰酶（histone deacetylases，HDACs）催化。組蛋白N端賴氨酸的乙?；腿ヒ阴；揎椄淖兞撕诵◇w的構(gòu)型，在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。組蛋白的N末端富含賴氨酸，生理?xiàng)l件下帶正電，它可與帶負(fù)電的DNA或相鄰的核小體發(fā)生作用，導(dǎo)致核小體構(gòu)象緊湊及染色質(zhì)高度折疊，從而抑制轉(zhuǎn)錄。當(dāng)組蛋白乙?；复呋嚢彼岚l(fā)生乙?；コ砻娴恼姾?，使其與DNA間的作用減弱，導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)象松散，有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的接近和結(jié)合，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。HDACs從賴氨酸上去除乙?；鶊F(tuán)，導(dǎo)致基因的表達(dá)沉默。乙?；揎検强赡娴?，其乙?；乃胶蜖顟B(tài)受HAT和DHAC的平衡調(diào)節(jié)。核小體組蛋白的異常去乙?；?，可能由特異性HDACs失調(diào)引起，從而與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，例如，一些類型的白血病中的基因易位可以產(chǎn)生一些融合蛋白，可以募集HDAC結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)使這些基因的表達(dá)沉默[10]，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[11，12，13，14，15]。

DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的主要方式，這兩種方式相互協(xié)調(diào)，共同實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控。大量的臨床和基礎(chǔ)研究結(jié)果表明，表觀遺傳學(xué)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，從而成為腫瘤治療的新靶標(biāo)，也成為腫瘤診斷及預(yù)后的重要參數(shù)。本文對(duì)表觀遺傳調(diào)控與膀胱腫瘤的關(guān)系及其在腫瘤診斷、治療及預(yù)后中的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1.膀胱癌中的DNA高甲基化

DNA高甲基化在人類惡性腫瘤中是最為常見(jiàn)的一種表觀遺傳學(xué)異常。在復(fù)習(xí)的

已發(fā)表的文獻(xiàn)中，膀胱癌中有甲基化狀態(tài)異常的基因設(shè)計(jì)多個(gè)細(xì)胞通路：細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、腫瘤抑癌基因、凋亡、細(xì)胞分化等等。這些基因在膀胱癌中失活的原因大多是啟動(dòng)子的高甲基化引起的。這些基因異常失活可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。膀胱癌中這些基因的失活與臨床分期、病理分級(jí)、腫瘤復(fù)發(fā)和病人生存與后有一定的關(guān)系[16，17，18]。

1.1.細(xì)胞周期相關(guān)基因

腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要特征是增殖能力的改變，這通常和細(xì)胞周期調(diào)控的異常有關(guān)。細(xì)胞周期的調(diào)控由多個(gè)基因如RB1、CDKs、cyclins、CDKIs等參與的小包周期調(diào)控點(diǎn)完成。其中CDKsRUO p14ARF和p16INK4a是細(xì)胞周期進(jìn)行的負(fù)性抑制因子，一般被認(rèn)為是抑癌基因。這2個(gè)基因有相同的轉(zhuǎn)錄模板，取保在于他們的第一外顯子和啟動(dòng)子區(qū)域核酸序列的不同，這些基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化引起的轉(zhuǎn)錄失活可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。在膀胱癌中，這2個(gè)基因的啟動(dòng)子高甲基化已經(jīng)被廣泛研究[17]，伴隨發(fā)生的還有雜合子的缺失（LOH）、純合子缺失（homozygous deletion）以及點(diǎn)突變。p14ARF和p16INK4a的甲基化頻率和膀胱癌的病例分級(jí)以及患者的預(yù)后都明顯相關(guān)。

1.2.細(xì)胞結(jié)構(gòu)基因

鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白粘附系統(tǒng)對(duì)維持正常組織結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，這一系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有賴于粘附分子家族的蛋白。CDH1和其他粘附分子在很多腫瘤中的表達(dá)都有不同程度下降，且預(yù)示腫瘤患者預(yù)后不良[16]。在膀胱癌中，CDH1啟動(dòng)子的高甲基化和CDH1的低表達(dá)與腫瘤分期、分級(jí)預(yù)后有明顯的關(guān)系[11]。然而CDH1啟動(dòng)子甲基化的頻率在各個(gè)研究中卻不盡相同，有的呈現(xiàn)出較高的甲基化水平[20]，而也有人報(bào)導(dǎo)的甲基化程度相當(dāng)?shù)蚚17]。另外還有研究表明CDH1啟動(dòng)子的高甲基化可以在正常膀胱上皮里面隨著衰老而出現(xiàn)[12]。這些結(jié)果還需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)價(jià)。

1.3 .DNA損傷修復(fù)基因

DNA修復(fù)是DNA損傷后維持基因組穩(wěn)定性的修正機(jī)制。在膀胱癌中有2個(gè)DNA修復(fù)相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)存在高甲基化的情況：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Pi（GSTP1）和O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）[17]。GSTP1屬于谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶超（GSTs）家族成員，通過(guò)促進(jìn)谷胱甘肽的結(jié)合反映在親電成分的致毒劑的解毒過(guò)程中起重要作用。GSTP1啟動(dòng)子在前列腺癌中甲基化的頻率高達(dá)70%-100%[13]，而在膀胱癌中相對(duì)較低約11%-59%[13]。GSTP1的失活可以導(dǎo)致DNA氧化損傷效應(yīng)的累加，最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定而致癌。MGMT是通過(guò)移除基因組DNA上的烷基加合物來(lái)參與DNA修復(fù)的。缺少M(fèi)GMT表達(dá)的腫瘤可以導(dǎo)致P53和K-ras的編碼基因點(diǎn)突變的頻率增高[14]。而且，MGMT缺陷的腫瘤表現(xiàn)出對(duì)烷基化療藥物的高敏感性。在膀胱癌中，MGMT的啟動(dòng)子也呈現(xiàn)出不同程度的甲基化狀態(tài)[17]。

1.4.可能的腫瘤抑制基因

膀胱癌中經(jīng)典的腫瘤抑制基因如VHL和MLH1存在不同程度功能缺失，他們甲基化的程度并不高，在4%-25%之間。然而一些可能的腫瘤抑制基因在膀胱癌中存在高甲基化引起的基因沉默，最引人注目的是RASSF1（ras association domain family 1 gene）基因。RASSF1定位于染色體3p21.3，編碼一個(gè)與ras效應(yīng)強(qiáng)蛋白相似的蛋白。盡管RASSF1的生物學(xué)功能還不為人所熟知，在體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)中它在腫瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可以引起細(xì)胞的細(xì)胞周期組織、生長(zhǎng)的抑制等效應(yīng)[16]。在膀胱癌中RASSF1啟動(dòng)子的甲基化是個(gè)常見(jiàn)的現(xiàn)象，發(fā)生率大約為32%-67%[17]。RASSF1啟動(dòng)子的高甲基化與腫瘤病理學(xué)特征及病人的預(yù)后明顯相關(guān)。

另外一些基因，如DBC1和IGFBP3也被認(rèn)為是可能的抑癌基因在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)高甲基化而表觀失活的情況。但是他們的高甲基化狀態(tài)是否在膀胱癌的發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色還不得而知，他們能否作為膀胱癌診斷的腫瘤標(biāo)記物還需要進(jìn)一步的研究。

1.5.凋亡相關(guān)基因

凋亡途徑也經(jīng)常受表觀遺傳調(diào)控，一些凋亡相關(guān)的基因如BCL2、DAPK、EDNRB、PYCARD、TERT和TNFRSF都直接或間接受甲基化的調(diào)控[17]。其中，DAPK是鈣調(diào)節(jié)的蛋白激酶，是個(gè)前凋亡蛋白，參與INF-gamma誘導(dǎo)的凋亡。在膀胱癌中啟動(dòng)子甲基化研究的最多的是DAPK基因，DAPK的啟動(dòng)子高甲基化與腫瘤的復(fù)發(fā)有明顯相關(guān)。

1.6.其他基因

Wnt蛋白家族對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮非常重要的作用。因此，wnt拮抗相關(guān)蛋白甲基化導(dǎo)致的表觀失活可以直接過(guò)度激活wnt/beta-catenin信號(hào)通路，從而引發(fā)不同腫瘤的發(fā)生。Wnt拮抗相關(guān)蛋白如APC、Wif-1、Dkk、sFRP-1、sFRP-2、sFRP-5、sFRP-4在膀胱癌中都發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子高甲基化情況。MSP可以作為膀胱癌患者一個(gè)有效的診斷和預(yù)后工具[17]。RARB和MDR1的甲基化也在膀胱癌中發(fā)現(xiàn)存在啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)[18]。

2.膀胱癌中的DNA低甲基化

DNA甲基化是哺乳動(dòng)物基因組避免重復(fù)DNA序列轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制。正常甲基化的DNA的去甲基化能擾亂這一機(jī)制，導(dǎo)致基因組結(jié)構(gòu)和功能的改變。DNA低甲基化是遺傳印跡（LOI）丟失的機(jī)制之一.類肝素酶（HPSE）在膀胱癌中的異常表達(dá)歸功于其啟動(dòng)子的低甲基化狀態(tài)[15]。

3. 腫瘤的表觀遺傳治療

基因突變不可逆，而表觀遺傳修飾是可逆的。這一特點(diǎn)使表觀遺傳修飾成為腫瘤治療的新靶標(biāo)，從而推動(dòng)新的腫瘤治療學(xué)的發(fā)展。目前基于表觀遺傳學(xué)的腫瘤治療方法主要是甲基化抑制劑和組蛋白去乙?；种苿┑膽?yīng)用. 目前運(yùn)用最多的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-deoxycytidine，5-Aza-CdR），其為一種嘧啶核苷類似物，在DNA復(fù)制過(guò)程中，可以與DNMT結(jié)合形成一種共價(jià)復(fù)合物，抑制該酶的甲基轉(zhuǎn)移活性，從而達(dá)到去甲基化作用，使多種因甲基化而失活的抑癌基因重新表達(dá)[17]。最近也有新的DNMT抑制劑在膀胱癌的治療上嘗試，如Zebularine，它能重新激活腫瘤抑制基因如P16INK4a和凋亡相關(guān)基因APAF-1和DAPK-1[18]。5-Aza-CdR已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)可以應(yīng)用在血液系統(tǒng)的腫瘤治療上[19]。然而，5-Aza-CdR在實(shí)體瘤治療上的應(yīng)用還沒(méi)有，其在膀胱癌上的應(yīng)用應(yīng)該十分謹(jǐn)慎。最近的研究表明，HDAC抑制劑和其他抗腫瘤藥物的聯(lián)合使用具有更加廣闊的應(yīng)用前景。如TSA和5-Aza-CdR聯(lián)用應(yīng)用治療白血病，可以減少5-Aza-CdR的毒副作用，并達(dá)到協(xié)同增效作用，還可以重新激活多種抑癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[16]。

4. 表觀遺傳與腫瘤診斷

DNA甲基化在不同組織中具有不同模式，這為腫瘤的早期診斷提供了一定的依據(jù)，因此，一些研究者將微陣列技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌、肺癌和卵巢癌等腫瘤CpG島甲基化模式的研究，獲得的CpG島甲基化譜，不僅可作為上述腫瘤患者的早期診斷指標(biāo)，還與腫瘤的病理分型、藥物治療敏感性和預(yù)后判斷直接相關(guān)。因此，表觀遺傳標(biāo)記在臨床腫瘤的診斷中發(fā)揮了重要作用。目前常用的甲基化特異PCR（methylation-specific PCR，MSP）可用于檢測(cè)一些體液或組織中癌細(xì)胞的某些抑癌基因CpG島高甲基化基狀態(tài)。MSP方法快速、無(wú)放射性、靈敏度高，目前已成為甲基化檢測(cè)的常用方法。然而，到目前為止膀胱癌特異性的基因甲基化檢測(cè)還沒(méi)有出現(xiàn)，幾種基因聯(lián)合檢測(cè)也許會(huì)是膀胱癌表觀遺傳學(xué)檢測(cè)的一個(gè)方向。有一項(xiàng)研究將8個(gè)腫瘤標(biāo)記物如RASSF1、CDH1和APC等聯(lián)合分析，結(jié)果大大提高了膀胱癌檢出的敏感性和特異性[20]。對(duì)已經(jīng)確診的膀胱癌患者，其特定基因的甲基化狀態(tài)也應(yīng)該得到確認(rèn)，與病理學(xué)資料結(jié)合分析，是期待找到更加清楚預(yù)后狀況的一種方法。總之，可以預(yù)見(jiàn)在將來(lái)，甲基化的檢測(cè)在膀胱癌快速診斷、預(yù)后、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和放化療敏感性各個(gè)方面的將發(fā)揮更大的作用。

5.展望

大量的證據(jù)已經(jīng)顯示DNA甲基化見(jiàn)車可以作為一個(gè)有前途的腫瘤標(biāo)記物，然而在膀胱癌中還沒(méi)有那個(gè)基因表現(xiàn)出足夠的敏感和特異性。進(jìn)一步的研究應(yīng)該可以通過(guò)高通量的甲基化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新的膀胱癌特異性的異常甲基化裝態(tài)的基因。

目前了解啟動(dòng)子甲基化狀況的方法多以來(lái)與PCR的方法，有一定的缺陷，如果新的方法能夠更加準(zhǔn)確全面的了解基因組DNA甲基化情況，那將極大推動(dòng)表觀遺傳學(xué)在臨床上的應(yīng)用。

另外MicroRNAs作為新的表觀遺傳學(xué)工具在調(diào)節(jié)基因表達(dá)上的作用月來(lái)越被人說(shuō)熟知，毫無(wú)疑問(wèn)，未來(lái)幾年，MicroRNAs在膀胱癌上診斷和治療上的作用的發(fā)現(xiàn)是非常值得人們期待的。

參考文獻(xiàn)

1. Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.（2008）Cancer statistics，2008.CA Cancer J Clin 58：71–96

2. Parkin DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.（2005）Global cancer statistics，2002. CA Cancer J Clin 55：74–108

3. Holmang S，Hedelin H，Anderstrom C，et al.（1995）The relationshipamong multiple recurrences，progression and prognosis of patients with stages Ta and T1 transitional cell cancer of the bladder followed for at least 20 years. J Urol 153：1823–1826

4. Mitra AP，Datar RH，Cote RJ（2006）Molecular pathways in invasive bladder cancer：new insights into mechanisms，progression，and target identifi cation. J Clin Oncol 24：5552–5564

5. Kawakami K，Enokida H，Tachiwada T，et al.（2007）Increased SKP2 and CKS1 gene expression contributes to the progression of human urothelial carcinoma. J Urol 178：301–307

6. Kawakami K，Enokida H，Tachiwada T，et al.（2006）Identifi cation of differentially expressed genes in human bladder cancer through genome–wide gene expression profi ling. Oncol Rep 16：521–531

7. Wolffe AP，Matzke MA（1999）Epigenetics：regulation through repression. Science 286：481–486

8. Gardiner–Garden M，F(xiàn)rommer M（1987）CpG islands in vertebrate genomes. J Mol Biol 196：261–282

9. Bird AP（1986）CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature 321：209–213

10. Baylin SB，Makos M，Wu JJ，et al.（1991）Abnormal patterns of DNA methylation in human neoplasia：potential consequences for tumor progression. Cancer Cells 3：383–390

11. Felsenfeld G，Groudine M（2003）Controlling the double helix. Nature 421：448–453

12. Zhang Y，Reinberg D（2001）Transcription regulation by histone methylation：interplay between different covalent modifi cations of the core histone tails. Genes Dev 15：2343–2360

13. Jenuwein T，Allis CD（2001）Translating the histone code. Science 293：1074–1080

14. Marks PA，Rifkind RA，Richon VM，et al.（2001）Inhibitors of histone deacetylase are potentially effective anticancer agents. Clin Cancer Res 7：759–760

15. Xu W，Cho H，Evans RM（2003）Acetylation and methylation in nuclear receptor gene activation. Methods Enzymol 364：205– 223

16. Markl ID，Cheng J，Liang G，et al.（2001）Global and gene-specific epigenetic patterns in human bladder cancer genomes are relatively stable in vivo and in vitro over time. Cancer Res 61：5875–5884

17. Marsit CJ，Houseman EA，Schned AR，et al.（2007）Promoter hypermethylation is associated with current smoking，age，gender and survival in bladder cancer. Carcinogenesis 28：1745–1751

18. Marsit CJ，Karagas MR，Danaee H，et al.（2006）Carcinogen exposure and gene promoter hypermethylation in bladder cancer. Carcinogenesis 27：112–116

19. Fernandez PL，Jares P，Rey MJ，et al.（1998）Cell cycle regulators and their abnormalities in breast cancer. Mol Pathol 51：305–309

20. Kawamoto K，Enokida H，Gotanda T，et al.（2006）p16INK4a and p14ARF methylation as a potential biomarker for human bladder cancer. Biochem Biophys Res Commun 339：790–796

通訊作者：徐志剛 重慶市紅十字會(huì)醫(yī)院（江北區(qū)人民醫(yī)院）泌尿外科 重慶市江北區(qū)嘉陵一村一號(hào) 400020。郵箱：xzgas@163.com。

重慶市江北區(qū)科委資助項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：20140215