王璇，張旗，方成，周澤坤，劉治田

1.武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北武漢 430205；

2.等離子體化學與新材料湖北省重點實驗室（武漢工程大學），湖北武漢 430205

Bola表面活性劑與牛血清蛋白相互作用的光譜研究

王璇，張旗*，方成，周澤坤，劉治田

1.武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北武漢 430205；

2.等離子體化學與新材料湖北省重點實驗室（武漢工程大學），湖北武漢 430205

采用熒光光譜法、紫外吸收光譜法和圓二色譜法研究了在Na2HPO3-NaH2PO3緩沖溶液（pH=7.4，298 K）中三種不同頭基的Bola表面活性劑Bola（Me）、Bola（Et）、Bola（Pr）與牛血清蛋白（BSA）的相互作用，考察了表面活性劑濃度、結構對相互作用的影響，初步闡明了Bola表面活性劑與BSA的結合機理.結果表明：三種Bola表面活性劑均對BSA的熒光強度有靜態(tài)猝滅作用，并導致其最大發(fā)射波長藍移；表面活性劑的加入主要影響B(tài)SA的色氨酸（Trp）殘基；表面活性劑頭基的烷基鏈越長，Stern-Volmer猝滅常數(shù)越大，表明具有較長頭基烷基鏈的表面活性劑與BSA具有更強的相互作用.

Bola表面活性劑；牛血清蛋白；熒光光譜；圓二色譜

蛋白質-表面活性劑復配體系的研究一直是人們十分感興趣的課題，因為它們在食品、生物、醫(yī)藥、化妝品領域有著重要而廣泛的應用［1-5］.已有文獻報道的關于表面活性劑與蛋白質相互作用的研究，大多集中于常見的如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）或者十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）等單鏈表面活性劑，而與Bola表面活性劑相關的還很少［6-9］.20世紀80年代，德國的Fuhrhop［10］教授首先使用了Bola兩親化合物（Bola-amphiphile）這一名詞.與只含有一個親水基和一個親油基的傳統(tǒng)表面活性劑不同，Bola型表面活性劑是由兩個極性頭基用一根或多根疏水鏈連接鍵合起來的化合物［11］.因此相對于同類型的傳統(tǒng)表面活性劑，Bola型表面活性劑的臨界膠束濃度（critical micelle con-centration，CMC）較高，Kfafft點較低，常溫下在水中具有較好的溶解性等特點［12］.由于具有特殊結構和強的親水性，Bola表面活性劑有望表現(xiàn)出更有效的與蛋白質相互作用的行為.

本文利用熒光光譜［13］、紫外吸收光譜［14］以及圓二色光譜［15］研究了Bola（Me）、Bola（Et）、Bola（Pr）三種不同疏水頭基的Bola表面活性劑與BSA在pH=7.4的Na2HPO3-NaH2PO3緩沖溶液中的相互作用，并結合實驗數(shù)據(jù)得到的猝滅常數(shù)等參數(shù)，初步闡明了Bola表面活性劑與BSA的結合機理及作用規(guī)律，特別是Bola表面活性劑的不同頭基烷基鏈對二者相互作用的影響.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：BSA，BR級，純度＞99.0%，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；3種不同疏水頭基的Bola表面活性劑（Bola（Me）、Bola（Et）、Bola（Pr））按文獻［16］方法自制，結構式如圖1；pH=7.4的Na2HPO3-NaH2PO3緩沖溶液（PBS），由磷酸氫二鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）和磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）配制而成.本文中若無特別說明，均以此緩沖溶液作為溶劑配制實驗所用溶液.

圖1 Bola表面活性劑的結構式［Bola（Me）、Bola（Et）、Bola（Pr）］Fig.1Structure of Bola surfactants［Bola（Me），Bola（Et），Bola（Pr）］

儀器：FP-6500型熒光分光光度計（日本），Per-kin Elmer Lambda 35紫外可見分光光度計（美國），J-1500型圓二色光譜儀（日本），5 μL微量進樣器（上海安亭微量進樣器廠），200 μL移液器（上海攜科生物科技有限公司），BSA 124S電子天平.

1.2 實驗方法

1.2.1 內源熒光光譜BSA的原溶液（1.0× 10-5mol/L）用PBS溶液配制，冷藏保存，使用前稀釋到所需濃度.移取3 mL BSA原溶液于5 mL石英比色皿中，使用微量進樣器逐次加入5 μL表面活性劑濃溶液，采用熒光光譜儀在室溫（298 K）下記錄BSA在290 nm～450 nm的熒光激發(fā)光譜，固定激發(fā)波長為280 nm，狹縫寬度為10/2.5 nm.

1.2.2 同步熒光光譜在室溫（298 K）下分別記錄BSA在3種Bola表面活性劑存在下在激發(fā)和發(fā)射波長差Δλ分別為20 nm和60 nm時的同步熒光光譜，狹縫寬度為10/2.5 nm，掃描范圍為200 nm～450 nm.

1.2.3 紫外吸收光譜配制一定濃度的BSA與Bola表面活性劑的混合溶液，室溫（298 K）下掃描其紫外吸收光譜，掃描范圍為200 nm～350 nm.

1.2.4 圓二色光譜配制一定濃度的BSA以及BSA與Bola表面活性劑的混合溶液，注入1 mm路徑的圓形石英比色皿中，室溫（298 K）下在圓二色光譜儀上掃描其圓二色譜，掃描范圍為190 nm～260 nm，掃描間隔為0.5 s.

2 結果與討論

2.1 Bola表面活性劑對BSA的熒光猝滅作用

BSA的內源熒光主要來自于分子中酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）殘基，它們在某些物質的作用下會發(fā)生熒光猝滅［17］.實驗表明：固定BSA的量，分別向其中加入一定濃度的表面活性劑溶液，3種Bola表面活性劑［Bola（Me）、Bola（Et）、Bola（Pr）］均能在與BSA的相互作用中猝滅BSA的熒光強度，BSA的內源熒光譜圖出現(xiàn)相似的變化規(guī)律.圖2為25℃下，Bola（Me）猝滅BSA的熒光光譜圖，BSA分子中色氨酸殘基的最大熒光強度的波長位于約345 nm左右.隨著Bola（Me）的加入，表面活性劑的濃度增加，BSA的內源熒光強度呈現(xiàn)有規(guī)律的下降，但其熒光光譜圖峰形是不變的，表明Bola（Me）對BSA的熒光有猝滅作用.同時，BSA的最大發(fā)射波長有明顯的藍移現(xiàn)象，當Bola（Me）的濃度從0 μmol/L增大到80 μmol/L時，BSA的最大發(fā)射波長從343 nm藍移到327 nm，這可能是由于Bola表面活性劑的加入使BSA所處的微環(huán)境發(fā)生了變化.

圖2 Bola（Me）濃度對BSA（10 μmol/L）熒光強度的影響Fig.2Effect of surfactant Bola（Me）concentration on the fluorescence intensity of BSA（10 μmol/L）

3種Bola表面活性劑的濃度對BSA的熒光最大發(fā)射波長的影響如圖3，隨著Bola表面活性劑濃度的增大，BSA的熒光最大發(fā)射波長均出現(xiàn)不同程度的藍移現(xiàn)象.原因可能是，隨著表面活性劑濃度的增加，BSA與Bola表面活性劑陽離子頭基之間的靜電吸引和烷基鏈間的疏水作用增強，從而使得BSA的構象發(fā)生改變［18］，造成Bola/BSA體系熒光發(fā)射最大波長藍移.對于含有不同鏈長疏水頭基的Bola表面活性劑，可以觀察到Bola/BSA體系最大熒光波長藍移程度大小變化順序為：Bola（Me）＜Bola（Et）＜Bola（Pr）.表明在同一溫度下，頭基的烷基鏈越長，Bola/BSA體系熒光發(fā)射最大波長藍移程度越大，Bola表面活性劑與BSA的相互作用越強，該結果與文獻報道類似［19-20］.

圖3 Bola表面活性劑濃度對BSA（10 μmol/L）最大發(fā)射波長的影響Fig.3Effect of Bola surfactants concentration on the maximum emission wavelength of BSA（10 μmol/L）

熒光物質的熒光猝滅機理通常可以分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種，動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質之間的激發(fā)態(tài)的能量轉移或電子轉移過程，靜態(tài)猝滅則是由于熒光物質與猝滅劑發(fā)生配合作用，產(chǎn)生了不發(fā)熒光的配合物［21］.若將Bola表面活性劑溶液對BSA熒光的猝滅歸因于分子碰撞引起的動態(tài)猝滅，按照Stern-Volmer方程［22］

式中，F(xiàn)0和F分別為加入Bola表面活性劑前后BSA的熒光強度；KSV為Stern-Volmer動態(tài)猝滅常數(shù)；［Q］為猝滅劑濃度，這里指Bola表面活性劑的濃度c；kq為雙分子猝滅常數(shù)；τ0一般約為10-8s-1，是熒光物質在不存在猝滅劑情況下的熒光壽命［23］.以F0/F對c作圖，得到Bola/BSA體系發(fā)生熒光猝滅的Stern-Volmer圖，如圖4所示，圖中直線的斜率即為動態(tài)猝滅常數(shù)KSV.

圖4 Bola/BSA體系的Stern-Volmer圖Fig.4Stern-Volmer curves of the systems of Bola/BSA

由圖4可以求得，Bola（Me），Bola（Et）及Bola（Pr）3種Bola表面活性劑對BSA的熒光猝滅的猝滅常數(shù)KSV分別為2.91×104mol/L，3.17×104mol/L，3.46×104mol/L.根據(jù)公式（2）可以得到kq分別為2.91×1012mol/（L·s），3.17×1012mol/（L·s），3.46× 1012mol/（L·s），如表1所示.而生物大分子被各類猝滅劑猝滅最大碰撞猝滅常數(shù)約為2.0×1010mol/（L·s）［24］.顯然，BSA被Bola表面活性劑猝滅的猝滅速率遠大于碰撞控制的kq，由此可推測，該猝滅過程可能包含靜態(tài)猝滅［25］.

表1 Bola/BSA體系的KSV和kq值Tab.1KSVandkqof Bola/BSA systems

2.2 紫外吸收光譜（ultraviolet，UV）

圖5給出了Bola（Et）加入前后BSA的紫外吸收光譜，從圖中可以看出，BSA在208 nm左右有最大吸收峰，對應BSA分子中肽鍵和芳香殘基的紫外吸收，隨著Bola（Et）的濃度的增加，兩種基團的紫外吸收顯著減少.這就表明BSA和Bola（Et）可能形成了復合物，致使肽鍵和芳香殘基的環(huán)境發(fā)生改變，從而導致其紫外吸收特性發(fā)生改變.由此結合Stern-Volmer方程可以推斷，Bola表面活性劑對BSA的熒光猝滅機理中包含靜態(tài)猝滅過程.

圖5 Bola（Et）/BSA的紫外吸收光譜Fig.5UV spectra of Bola（Et）/BSA

2.3 同步熒光光譜（synchronous fluorescence，SF）

當小分子化合物與BSA結合時通常會引起B(yǎng)SA構象的變化，BSA的熒光主要來自色氨酸（Trp）殘基和酪氨酸（Tyr）殘基，而Trp和Tyr具有相似的熒光光譜.據(jù)報道［26］，色氨酸的熒光最大發(fā)射波長跟其所處的微環(huán)境的極性有關，同步熒光光譜能有效的區(qū)分BSA中色氨酸殘基（Δλ=60 nm）和酪氨酸殘基（Δλ=20 nm）.所以進行了同步熒光實驗，3種Bola表面活性劑的規(guī)律相似，下面以不同濃度Bola（Me）存在時BSA的同步熒光光譜為例討論，如圖6（a，b）.

從圖中可見，隨著Bola（Me）濃度的增加，BSA的熒光峰強度顯著降低.同時，Trp的熒光強度比Tyr的熒光強度要大，說明Trp對BSA的熒光強度貢獻大.圖6（a）中Δλ=20 nm時，隨著Bola（Me）濃度的增加，BSA的最大發(fā)射波長基本沒有變化.而圖6（b）中Δλ=60 nm時，BSA的最大發(fā)射波長隨著Bola（Me）濃度的增加從283 nm藍移到275 nm，即色氨酸殘基隨著Bola表面活性劑的加入發(fā)生了的輕微的構象變化，可以推斷出Bola表面活性劑主要是與BSA分子中的色氨酸（Trp）殘基發(fā)生相互作用.

圖6 Bola（Me）濃度對BSA（10 μmol/L）同步熒光的影響Fig.6Effect of surfactans Bola（Me）concentration on SF spectra of BSA（10 μmol/L）

2.4 圓二色光譜（circular dichroism，CD）

蛋白質分子中存在著多種二級結構，其中包括4種主要結構，α-螺旋，β-折疊，β-轉角和無規(guī)卷曲，并且各種二級結構的譜圖的形狀也不同，蛋白質分子二級結構中α-螺旋的量的減少可以反映蛋白質分子的展開程度［27］.為了研究Bola表面活性劑對BSA分子結構的影響，測量了波長在190 nm～260 nm范圍內的圓二色譜，如圖7所示為3種Bola表面活性劑［Bola（Me）、Bola（Et）、Bola（Pr）］與BSA相互作用的圓二色譜圖.

如圖7，在波長約為208 nm和222 nm時，BSA具有兩個負帶在紫外區(qū)的CD光譜，這兩個凹槽表征的是BSA的α-螺旋結構［28］.同時可以觀察到，隨著Bola/BSA的摩爾比的增大，BSA的摩爾橢圓率逐漸增大，表明BSA的二級結構發(fā)生了變化，即α-螺旋結構的含量逐漸減少.由于蛋白質的圓二色譜圖是多種二級結構共同作用的結果，為了深入研究Bola表面活性劑對BSA分子結構的影響，通過測得的BSA圓二色譜數(shù)據(jù)，計算得到BSA分子中各種二級結構的含量，如表2所列即為加入3種Bola表面活性劑前后BSA中二級結構含量的變化.

圖7 不同Bola/BSA體系摩爾比下的圓二色譜Fig.7CD spectra of BSA at different molar ratios in Bola/BSA systems

表2 BSA二級結構含量隨不同Bola/BSA摩爾比的變化Tab.2The secondary structure of BSA with different Bola/BSA molar ratio

由表2可以看出，對于這3種Bola表面活性劑，隨著表面活性劑含量的增加，BSA分子中α-螺旋的含量降低，而β-折疊的含量顯著增加，說明BSA分子的肽鏈發(fā)生了解螺旋現(xiàn)象.在Bola/BSA摩爾比為10時，BSA的二級結構變化不大，Bola（Et）只使BSA的二級結構發(fā)生了微小的變化，α-螺旋從55.4%減小到了52.8%，β-折疊從7.5%增大到了10.7%；而Bola（Me）和Bola（Pr）的α-螺旋含量出現(xiàn)輕微的增加，這可能是由于低濃度的表面活性劑的加入使BSA的結構不穩(wěn)定所致.隨著n（Bola）/n（BSA）摩爾比的增大，在Bola/BSA的摩爾比為100時，Bola（Me）使BSA的α-螺旋從55.4%減小到42.0%，β-折疊從7.5%增大到23.1%，變化比較明顯；Bola（Pr）使BSA的α-螺旋從55.4%減小到38.9%，β-折疊從7.5%增大到28.1%，即變化非常明顯；Bola（Et）的二級結構變化則介于二者之間.通過分析圓二色譜圖計算得到的BSA二級結構的含量可以推斷，Bola表面活性劑加入后引起了BSA二級結構的的變化，且Bola表面活性劑的頭基的烷基鏈越長，疏水性越強，對BSA二級結構的影響越大，該結果與上文中熒光光譜結果吻合.

3 結語

本文利用熒光光譜、紫外吸收光譜以及圓二色光譜研究了系列3種不同疏水頭基的Bola表面活性劑（Bola（Me）、Bola（Et）、Bola（Pr））與牛血清蛋白（BSA）在pH=7.4的Na2HPO3-NaH2PO3緩沖溶液中的相互作用，結果表明Bola表面活性劑對BSA的熒光強度有猝滅作用，且熒光猝滅現(xiàn)象中包含靜態(tài)猝滅過程.表面活性劑主要和BSA的Trp殘基相互作用導致BSA的構象發(fā)生改變.3種Bola表面活性劑對兩者相互作用的影響主要體現(xiàn)在：隨著表面活性劑頭基的烷基鏈增長，熒光猝滅作用增強，BSA的二級結構變化增大，說明在Bola表面活性劑與BSA的相互作用中，頭基烷基鏈的長度是一個重要因素.這項研究對于理解Bola表面活性劑和BSA之間的相互作用，拓展其在生物、醫(yī)藥領域中的潛在應用具有重要意義.

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本文編輯：張瑞

Spectroscopic Studies on Interaction of Bovine Serum Albumin with Bola Surfactant

WANG Xuan，ZHANG Qi*，F(xiàn)ANG Cheng，ZHOU Zekun，LIU Zhitian
1.School of Materials Science and Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430205，China；
2.Hubei Key Laboratory of Plasma Chemical and Advanced Materials（Wuhan Institute of Technology），Wuhan 430205，China

Interaction between a Bola series of surfactants Bola（Me），Bola（Et）and Bola（Pr）with different headgroups and bovine serum albumin（BSA）in Na2HPO3-NaH2PO3buffer solution（pH=7.4，298 K）were studied by using fluorescence spectroscopy，UV absorption spectroscopy and circular dichroism spectroscopy in this paper.Effects of the surfactants structure and concentration on the interaction were examined，and the binding mechanism of Bola surfactants and BSA were elucidated.The experimental results showed that all the Bola surfactants had a static quenching effect on the fluorescence intensity of bovine serum albumin（BSA）and resulted in a blue shift of the maximum emission wavelength.The addition of surfactants mainly affected the tryptophan residues of BSA.The longer alkyl chain the surfactant has，the larger the Stern-Volmer quenching constant is，indicating that the surfactant with longer head alkyl chain has stronger interaction with BSA.

Bola surfactant；BSA；fluorescence spectrum；circular dichroism spectrum

O657

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2017.02.004

1674-2869（2017）02-0120-07

2017-01-22

武漢工程大學研究生教育創(chuàng)新基金（CX2015010）；湖北省教育廳科學技術研究計劃青年人才項目（Q20161511）；

中石油創(chuàng)新基金（2015D-5006-0211）；湖北省優(yōu)秀青年骨干人才（2016）

王璇，碩士研究生.E-mail：691125026@qq.com

*通訊作者：張旗，博士，講師.E-mail：48780905@qq.com

王璇，張旗，方成，等.Bola表面活性劑與牛血清蛋白相互作用的光譜研究［J］.武漢工程大學學報，2017，39（2）：120-126.

WANG X，ZHANG Q，F(xiàn)ANG C，et al.Spectroscopic studies on interaction of bovine serum albumin with bola surfactant［J］.Journal of Wuhan Institute of Technology，2017，39（2）：120-126.