張忠霞，邱會卿，孫美玉，韓冰，王銘維

丹參多酚酸對慢性束縛應激后小鼠認知功能障礙的改善作用及相關機制

張忠霞，邱會卿，孫美玉，韓冰，王銘維

目的 探討丹參多酚酸對慢性束縛應激后小鼠認知功能障礙的改善作用及相關機制。方法 采用3個月齡健康雄性昆明小鼠，隨機分為對照組、應激組和丹參多酚酸干預組(SA組)，每組14只小鼠。對照組和應激組小鼠每日腹腔注射生理鹽水，SA組小鼠每日腹腔注射丹參多酚酸注射液；應激組和SA組小鼠每日腹腔注射后，束縛制動8 h，連續(xù)14 d。采用新異物體識別試驗(NORT)、Morris水迷宮試驗檢測小鼠學習記憶能力的改變。采用HE染色觀察海馬神經元形態(tài)的改變。分別采用免疫組化法和實時熒光定量PCR檢測海馬腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白及mRNA的表達。 結果 應激組小鼠NORT試驗識別期對新物體的探索時間及新異物體差異指數均明顯低于對照組和SA組(均P<0.05)。應激組小鼠Morris水迷宮試驗每日逃避潛伏期均明顯長于對照組和SA組，第5 d探索平臺次數明顯少于對照組和SA組(均P<0.05)。HE染色結果顯示，對照組小鼠海馬神經元形態(tài)完整，未見明顯變化；應激組小鼠海馬神經元細胞體積縮小，部分神經元細胞呈泡狀改變；SA組可見到核輕度不規(guī)則，細胞形態(tài)接近于對照組神經元。應激組小鼠BDNF蛋白陽性細胞數和mRNA相對表達量均明顯少于對照組和SA組(均P<0.05)。結論 丹參多酚酸干預能明顯預防慢性束縛應激引起的認知功能損傷，其可能機制是能夠抑制慢性應激所致海馬BDNF表達的下降。

慢性束縛應激；丹參多酚酸；認知功能障礙；腦源性神經營養(yǎng)因子

應激是機體在各種內外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時所出現的全身性非特異性適應反應，又稱為應激反應[1]。長期慢性應激會導致認知功能的損傷，同時會引起神經內分泌系統(tǒng)和大腦蛋白的改變[2]。但是，應激影響認知的確切機制尚不清楚，臨床也缺乏有效的預防和治療藥物。丹參多酚酸具有多種藥理學作用，如抗炎、抗氧化、改善循環(huán)、清除自由基和神經保護等作用，不良反應少，具有良好的臨床應用潛力[3-5]。但目前尚未見其用于改善應激后認知功能障礙的報道。本實驗采用小鼠慢性束縛應激模型，觀察小鼠認知功能的改變，并應用丹參多酚酸，觀察其對小鼠認知功能的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取3個月齡雄性、健康、清潔級昆明種小鼠42只，體質量(28±2)g，動物合格證號醫(yī)動字第1303025號，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，單位許可證號SCXK冀2008-1-003。

1.1.2 主要儀器與試劑 新異物體識別實驗檢測裝置及ANY-maze圖像追蹤系統(tǒng)購于上海欣軟信息科技有限公司，SLY-WMS Morris水迷宮及其分析系統(tǒng)購于安徽淮北正華生物儀器有限公司；正置熒光顯微鏡購于日本NIKON公司，石蠟切片、展片、烤片機均購于德國LEICA公司；兔抗小鼠腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)抗體購于英國Abcam公司，SP兔來源免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司，RNA提取試劑盒購于成都福際生物技術有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒及熒光定量預混試劑購于天根生化科技有限公司，引物及堿基由生工生物工程上海股份有限公司合成，注射用丹參多酚酸為天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 所有動物于標準條件下飼養(yǎng)，室溫(20±2)℃，濕度(50±5)%，所有動物在非應激期自由攝食和飲水。每12 h交替光照。實驗動物在預適應1周后，隨機分為3組，每組14只小鼠。(1)對照組：每日腹腔注射0.9%生理鹽水，10 ml/kg，連續(xù)14 d；(2)應激組：每日腹腔注射0.9%生理鹽水，10 ml/kg，然后給予8 h(9:00～17:00)束縛應激刺激，連續(xù)14 d；(3)丹參多酚酸干預組(SA組)：每日腹腔注射配置濃度為6 mg/ml的丹參多酚酸溶液10 ml/kg，然后給予8 h(9:00～17:00)束縛應激刺激，連續(xù)14 d。束縛應激刺激方法：使用50 ml離心管，在離心管底壁前端、側壁和瓶蓋扎數個孔，保證空氣通暢，使呼吸、排泄均不受限，而且不會感到疼痛。小鼠頭部朝向離心管底部鉆入，尾部蓋上管蓋，封閉后的離心管固定于水平地面上，使頭部略高于尾部，以便尿液的排出。

1.2.2 新異物體識別試驗(NORT) 束縛應激刺激結束后，采用NORT檢測各組小鼠的認知功能。測試裝置為長寬高均為50 cm的正方體不透明盒子，正上方有照明，以避免明暗光線的差異對動物探索行為造成干擾；用來辨識的物體A、B為紅色等大長方體，C為粉色六邊體，固定置于箱底。測試前首先將小鼠置于空盒內適應30 min。在熟悉期，于盒子的兩側放置物體A和B，將小鼠背對物體放置在物體A、B之間，觀察并記錄5 min內小鼠對每個物體的探索時間，之后將動物放回原來的鼠籠。間隔1 h后，進行識別期測試。將物體B更換為新物體C，記錄小鼠在5 min內對物體A和新物體C的探索時間。每次測試結束，測試物體及測試箱都分別用75%乙醇進行擦拭，以消除氣味對小鼠探索行為和探索物體時間產生的影響。采用探索新物體的時間和新異物體的差異指數(DR)作為學習記憶的檢測指標。DR=探索新物體C的時間/(探索新物體C的時間+探索舊物體A的時間)，探索時間越長，DR越大，說明學習記憶能力越好。

1.2.3 Morris水迷宮試驗 Morris水迷宮由一直徑1.2 m、高0.5 m的圓形水池和安裝于正上方的自動攝像系統(tǒng)組成，水池被池壁上4個等距離點均分為4個象限。一直徑0.14 m、高0.2 m的透明平臺置于水下1.5～2 cm處，并保持固定。前4 d進行定位航行試驗，每日將小鼠分別從水迷宮的4個象限面向池壁放入水中，記錄其從入水到爬上平臺的時間，即逃避潛伏期。每次的最大潛伏期設置為120 s，若在設置時間內未找到，則記為120 s。將4次的算術平均值記為當日的成績。第5 d進行空間探索試驗。將水下的平臺撤掉，記錄小鼠120 s內游過原平臺位置的次數。

1.2.4 HE染色 行為學測試結束后，腹腔給予各組小鼠水合氯醛(0.3 ml/100 g)進行麻醉，4%體積分數的多聚甲醛灌注固定，脫水、透明、浸蠟、包埋，制作石蠟切片。切片脫蠟后經HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理后，用中性樹膠封片。光鏡下觀察海馬神經元形態(tài)的改變。

1.2.5 免疫組化染色及圖像分析 取材和組織處理同1.2.4，石蠟切片經二甲苯和梯度乙醇進行脫蠟和水化處理，微波修復，加兔抗小鼠BDNF抗體(1∶100)，進行常規(guī)免疫組織化學染色，DAB染色后，進行蘇木素復染，最后經梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，用中性樹膠封片，采集圖像并保存。以海馬區(qū)神經元胞漿出現棕色顆粒為陽性反應，計數BDNF染色陽性的細胞。每只小鼠取5張切片，每張切片在高倍視野下計數海馬區(qū)每個不重復視野陽性細胞數，得出5張切片的平均值為1只小鼠的細胞數。各組小鼠選擇切片的部位相同。

1.2.6 實時熒光定量PCR 行為學測試結束后取材，在冰臺上迅速剝離出新鮮海馬組織，按試劑盒說明提取海馬總RNA，進行RNA純度和濃度鑒定。以提取的總RNA為模板，按試劑盒的說明反轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR所用引物及堿基為：BDNF：F 5′-AGC TGA GCG TGT GTG ACA GT-3′，R 5′-ACC CAT GGG ATT ACA CTT GG-3′；GAPDH：F 5′-CCC CAA TGT ATC CGT TGTG-3′，R 5′-CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3′。PCR反應體系(20 μl體系)：2×SuperReal PreMix Plus 10 μl；正向引物(10 μM) 0.6 μl；反向引物(10 μM) 0.6 μl；cDNA模板1 μl；50×ROX Reference DyeΔ 0.4 μl；RNase-free ddH2O 7.4 μl。PCR反應程序：95℃ 15 min預變性→40個循環(huán)→95℃ 10 s變性→60℃ 32 s退火/延伸，采集熒光。實驗數據根據目的基因和參考基因各自的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算出各樣品中目的基因的相對表達量。

2 結 果

2.1 各組小鼠認知功能的比較 見表1、表2。在NORT試驗中，各組小鼠熟悉期探索時間差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；應激組小鼠識別期對物體C的探索時間及DR均明顯低于對照組和SA組(均P<0.05)。在Morris水迷宮試驗中，應激組小鼠每日逃避潛伏期均明顯長于對照組和SA組，第5 d探索平臺次數明顯少于對照組和SA組(均P<0.05)。

表1 各組小鼠NORT試驗成績的比較(x±s,n=14)組別熟悉期探索時間(s)物體A物體B識別期探索時間(s)物體A物體CDR對照組18.3±3.319.1±3.017.3±2.220.1±2.40.56±0.15應激組20.3±2.619.5±2.116.6±3.412.4±3.7*0.41±0.17*SA組17.5±3.217.8±3.315.5±2.317.6±2.3△0.57±0.16△ 注:與對照組比較*P<0.05;與應激組比較△P<0.05

表2 各組小鼠Morris水迷宮試驗成績的比較(x±s,n=14)組別第1d逃避潛伏期(s)第2d逃避潛伏期(s)第3d逃避潛伏期(s)第4d逃避潛伏期(s)第5d探索平臺次數(次)對照組21.6±5.317.9±6.011.3±4.26.1±2.37.6±2.7應激組28.3±6.4*24.5±7.1*17.6±5.4*13.8±3.7*4.4±2.4*SA組23.5±7.2△19.5±5.8△13.5±5.3△9.6±3.3△6.7±1.8△ 注:與對照組比較*P<0.05;與應激組比較△P<0.05

2.2 各組小鼠海馬神經元形態(tài)的比較 見圖1。HE染色結果顯示，對照組小鼠海馬區(qū)細胞排列整齊有序，細胞核呈圓形或橢圓形，形態(tài)完整，核染色質均勻未見明顯變化；應激組小鼠海馬神經元細胞體積縮小，部分神經元細胞呈泡狀改變；SA組可見到核輕度不規(guī)則，細胞形態(tài)接近于對照組神經元。

2.3 各組小鼠海馬BDNF蛋白表達的比較 見圖2、表3。應激組小鼠BDNF蛋白陽性細胞數明顯少于對照組和SA組(均P<0.05)。

2.4 各組小鼠海馬BDNF mRNA表達的比較 見表3。應激組小鼠BDNF mRNA相對表達量明顯少于對照組和SA組(均P<0.05)。

圖1 各組小鼠海馬神經元HE染色。A:對照組； B：應激組； C：SA組(×400) 圖2 各組小鼠海馬BDNF蛋白免疫組化染色。A:對照組； B：應激組； C：SA組(×400 )

3 討 論

丹參多酚酸是由中藥丹參的水溶性酚酸類化合物制成的凍干粉針劑，具有抗凝、抗炎、抗氧化、清除自由基、抑制內皮素釋放等作用[3-5]。目前的報道[6-7]主要集中于臨床，對抑制冠心病患者血小板的聚集和活化、抗腦缺血損傷具有顯著作用。而其對慢性應激所致的認知損傷是否具有干預作用，其作用機制如何，尚未見報道。

目前被廣泛認可的應激模型包括慢性不可預知性溫和應激模型、交流箱模型、慢性束縛應激模型等[8]。已有研究[9]證實，慢性束縛應激與人類心身疾病的過程具有相似性，不僅能夠引起心理病理改變，而且可對記憶產生影響。同時考慮到前兩種應激模式的刺激強度過大[10]，故本實驗應用慢性束縛應激模型進行實驗。Morris水迷宮是檢測動物空間學習記憶的經典試驗，NORT試驗可有效地檢測再認記憶，其理論依據是嚙齒類動物對于新異物體具有選擇偏愛性，二者考查的認知功能均與海馬區(qū)密切相關[11]。

本實驗結果顯示，應激組在定位航行試驗中找到平臺的逃避潛伏期顯著增長，在撤掉平臺的空間探索試驗中穿越原平臺所在位置的次數明顯減少，在NORT識別期對于新物體的識別程度明顯降低，說明慢性束縛應激損傷了小鼠的空間學習和情景再認記憶。而SA組的各項學習成績比單純應激組小鼠均有了顯著改善，說明丹參多酚酸可以明顯改善上述認知損傷。

長期應激會損傷鼠的海馬部位。Sapolsky等[12-13]報告慢性應激可以導致海馬錐體神經元缺失及認知功能的下降。BDNF作為腦組織中含量最豐富的神經營養(yǎng)因子，廣泛分布于皮質、海馬、下丘腦等部位，對于神經的發(fā)生、存活及增殖有重要的作用，并可增強突觸聯系，影響神經元的可塑性和神經遞質的合成[14]。已有研究[12,15]報道，BDNF能夠增強正常人的記憶能力以及長時程增強(LTP)，阻斷酪氨酸激酶B受體(TrkB，BDNF受體)或者應用BDNF抗體能夠抑制海馬腦片的LTP[15]。本實驗結果顯示，慢性束縛應激模型小鼠海馬神經元發(fā)生損傷，海馬區(qū)BDNF mRNA和蛋白的表達均降低，這與Aleisa等[16]和Gersner等[17]的研究一致。而提前給予丹參多酚酸后，海馬神經元形態(tài)未受到顯著影響，BDNF在基因與蛋白水平的表達未出現顯著下降，說明丹參多酚酸能夠預防慢性應激后海馬神經元的損傷，可以有效阻止BDNF的下調，從而發(fā)揮改善認知的功能，這些將為丹參多酚酸用于臨床治療認知功能障礙提供理論依據；而丹參多酚酸是如何上調BDNF的表達的，有待于進一步實驗研究。

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Improving effect of salvianolic acids on cognitive dysfunction caused by chronic restrain stress and its mechanism in mice

ZHANGZhong-xia,QiuHui-qing,SUNMei-yu,etal.

DepartmentofNeurology,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,BrainAgingandCognitiveNeuroscienceLaboratoryofHebeiProvince,Shijiazhuang050031,China

Objective To investigate the improving effect of salvianolic acids on cognitive dysfunction caused by chronic restraint stress and its mechanism in mice. Methods Healthy male Kunming mouse of 3-month aged were randomly divided into control group, stress group and salvianolic acids treating group (SA group), with 14 mouse in each group. Daily intraperitoneal injection of saline were given to the control group and stress group, while salvianolic acids were given to the SA group. Stress group and SA group were restrained for 8 h after injection every day for 14 d continually. Changes of learning and memory ability were tested by novel-object recognition task (NORT) and Morris water maze test. The hippocampal neuronal damage was observed by the HE staining. Protein and its mRNA expression of brain derived neurotrophic factor (BDNF) were detected by immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR respectively. Results The exploring time for the novel object and the difference index in NORT recognition unit of stress group were significantly lower than the control group and SA group (allP<0.05). Daily escape latency in Morris water maze test of stress group were significantly longer than control group and SA group, while the exploring time for platform was significantly less than control group and SA group (allP<0.05). HE staining showed that the hippocampal neurons morphology of control group was complet, and there was no obvious changes. The volum of hippocampal neurons was reduced, and part of them had vesicular changes in stress group. Slightly irregular of cell nuclear could be seen in SA group, close to the neurons of control group. The number of BDNF positive cells and relative expression of mRNA in stress group were significantly less than those in control group and SA group (allP<0.05). Conclusions Salvonolic acids can significantly improve cognitive dysfunction caused by chronic restraint stress. Its possible mechanism is that it can inhibit the decrease of BDNF expression in hippocampus cauced by chronic stress.

chronic restraint stress;salvonolic acids;cognitive dysfunction;brain derived neurotrophic factor

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2010CB535005)；河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(20160202)

050031 石家莊，河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經內科，河北省腦老化與認知神經科學實驗室

王銘維

R749.1

A

1004-1648(2017)02-0111-05

2016-08-10

2016-09-02)