付瑜華，賀爾奇，雷石富，李向勇，張正學，盧加舉

（貴州省亞熱帶作物研究所，貴州 興義 562400）

2種甘蔗病害脅迫果蔗NBS類抗病基因同源序列的表達分析

付瑜華，賀爾奇，雷石富，李向勇，張正學，盧加舉

（貴州省亞熱帶作物研究所，貴州 興義 562400）

在眼斑病和輪斑病病原菌侵染下，分析果蔗NBS類抗病基因同源序列在侵染初期的表達情況，為后續(xù)克隆關(guān)鍵抗病基因、研究抗病機理提供理論依據(jù)。已克隆的7條果蔗RGAs可視為來源不同的3個基因片段。將2種病原菌分別針刺接種到感病基因型黔糖3號和抗病基因型黔糖5號葉片后，3條果蔗RGAs在2種病害侵染初期均受到不同程度的上調(diào)，RGA12478對兩種病害的響應(yīng)最為迅速，RGA5的表達量最高，尤其在輪斑病菌的脅迫下，RGA5在脅迫后12 h的表達量大約分別是同時間點RGA12478和RGA36表達量的16倍和6倍。因此，RGA5可認為是果蔗在抵御輪斑病和眼斑病侵染初期發(fā)揮主要作用的抗病基因片段，后續(xù)應(yīng)結(jié)合RACE技術(shù)獲得基因全長，作為關(guān)鍵抗病候選基因研究其功能和在外源信號因子作用下的表達情況，全面了解該抗病基因的抗病機理。

果蔗；眼斑??；輪斑病；抗病基因同源序列；表達分析

抗病基因使植物在被動防衛(wèi)病原菌侵害的同時，能夠產(chǎn)生分子水平的防御反應(yīng)，使植物表現(xiàn)出局部或系統(tǒng)的抗性，減少病原菌對其的傷害。NBS-LRR類抗病基因含有核苷酸結(jié)合位點（NBS）和富亮氨酸重復(fù)（LRR）結(jié)構(gòu)域是最大的抗病基因家族?？茖W家最初通過轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)和圖位克隆的方法獲得了一批植物抗病基因［1-3］，但此方法并不適合基因組復(fù)雜的作物。通過抗病基因保守序列結(jié)構(gòu)特征設(shè)計簡并引物，對感興趣植物材料的DNA或cDNA進行擴增，可獲得該植物材料的抗病基因同源序列（RGA），這種方法簡單有效，已經(jīng)在多種作物中成功分離到了許多抗病基因同源片段［4-7］，再利用RACE技術(shù)，即可獲得完整的抗病候選基因［8-9］，或與分子標記技術(shù)相結(jié)合，借助其遺傳連鎖圖譜可將克隆到的RGAs定位在染色體上，再逐步找到抗病基因［10-12］。隨著越來越多植物的全基因組序列被公布，已經(jīng)在玉米、高粱、水稻、馬鈴薯和小果野蕉等多種植物中開展了基于全基因組的NBS類抗病基因的發(fā)掘和比較研究［13-15］。甘蔗基因組龐大，遺傳背景復(fù)雜，闕友雄等最先利用同源克隆技術(shù)從甘蔗高抗黑穗病品種NCo376中獲得了11條抗病基因同源序列，并對其中一條RGA進行了基因全長克隆，分析了該基因在黑穗病菌、過氧化氫和水楊酸脅迫下的表達特點及其在甘蔗不同組織部位的表達情況［9，16］，同時，對甘蔗近緣植物斑茅的基因組DNA和cDNA分別進行了RGAs的發(fā)掘［17-18］。

我國大陸蔗區(qū)已發(fā)現(xiàn)的甘蔗病害約50種［19］，其中眼斑病和輪斑病是蔗區(qū)常見的兩種葉部真菌型病害，在我國臺灣省、福建、廣西和貴州等省均有發(fā)生［20-23］，尤其在廣東和云南蔗區(qū)較為嚴重［24-26］，影響了甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)，在一定程度上限制了當?shù)馗收岙a(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。果蔗是人們可直接食用的水果型甘蔗，在生產(chǎn)過程中對農(nóng)藥的使用要求更為嚴格。李瑞美等對發(fā)展果蔗的無公害生產(chǎn)進行了研究［27］。利用現(xiàn)有果蔗資源，尋找抗病遺傳基礎(chǔ)，培育抗病果蔗品種，是實現(xiàn)果蔗無公害生產(chǎn)的基礎(chǔ)。與果蔗黔糖3號相比，黔糖5號在大田表現(xiàn)出對多種甘蔗病害不同的抗性，癥狀診斷、病原菌形態(tài)特征觀察和人工接種技術(shù)綜合鑒定評價表明黔糖5號高抗甘蔗眼斑病［28］。李向勇等通過對果蔗病害重災(zāi)區(qū)多年的病害調(diào)查，將輪斑病在黔糖3號的發(fā)病情況分為6個病害級別［29］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上［30］，對已獲得的7條果蔗NBS-LRR類抗病基因同源片段進行甘蔗眼斑病和輪斑病病原菌脅迫下的表達分析，以期獲得響應(yīng)這2種甘蔗病害的果蔗RGAs候選片段，為后續(xù)cDNA全長克隆及果蔗抗眼斑病、輪斑病的分子生物學研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黔糖3號和黔糖5號種莖經(jīng)熱水脫毒處理后，種植于貴州省亞熱帶作物研究所溫室大棚。7條果蔗NBS-LRR類抗病基因同源序列來源于賀爾奇等發(fā)表的文章［28］。熒光定量PCR檢測儀為BIO-RAD CFX Connect?，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和DNase I購于THERMO SCIENTIFIC公司，Power SYBR? Green PCR Master Mix購于Applied Biosystems公司，引物合成委托生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 2種甘蔗病害病原菌的分離及接種 收集大田中感染輪斑病和眼斑病的甘蔗葉片到實驗室，將葉片感病部位病原菌接種于PDA培養(yǎng)基中，分離單克隆，經(jīng)光學顯微鏡觀察判斷后，試管斜面劃線保存于冰箱。對植物葉片分別進行2種病原菌的針刺接種、棉球接種和菌餅接種，選擇致病力最強、最快的接種方式，確定為本實驗的接種方法。

待果蔗黔糖3號和黔糖5號生長至7～10葉片時，對兩個果蔗品種葉片進行病原菌接種，并在接種后0、6、12、18、24 h分別對2個果蔗品種接種部位葉片進行取樣，液氮速凍后保存于-80℃。

1.2.2 cDNA的獲得 采用Trizol法提取果蔗葉片RNA，并根據(jù)試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和 DNase I的說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得2個果蔗品種在3種病原菌脅迫不同時間點的葉片cDNA。

1.2.3 序列分析及特異引物設(shè)計 利用Clustal X軟件對已知7條果蔗NBS-LRR抗病基因同源序列進行多序列比對，根據(jù)序列比對結(jié)果，用Primer 5軟件設(shè)計引物。

1.2.4 表達分析 以甘蔗GAPDH基因為內(nèi)參基因（登陸號：CA254672）。qPCR反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，Primer F（10 μmol/L） 0.5μL，Primer R（10 μmol/L） 0.5μL，ddH2O 8μL，Power SYBR? Green PCR Master Mix 10 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃20 s，40個循環(huán)；在反應(yīng)結(jié)束后添加60～95℃的溶解曲線以分析擴增片段的特異性。采用相對定量分析方法對表達數(shù)據(jù)進行分析。

表 1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 輪斑病和眼斑病接種果蔗感病試驗

對保存的眼斑病和輪斑病病原菌進行活化，以果蔗感病基因型黔糖3號為對象，隨機選取3株長勢良好植株上的健康葉片進行針刺接種、棉球接種和菌餅接種，在接種病原菌后3 d 和6 d，觀察并記錄葉片發(fā)病情況，結(jié)果見表2，對于輪斑病病原菌來說，針刺接種和菌餅接種兩種方法均可使黔糖3號葉片產(chǎn)生可見病斑，而對于眼斑病來說，則是針刺接種和棉球接種兩種方法可使黔糖3號葉片產(chǎn)生可見病斑。根據(jù)3株黔糖3號葉片的發(fā)病情況，針刺接種的致病率明顯優(yōu)于其它兩種方法，因此，本研究選用針刺接種法對黔糖3號和黔糖5號葉片進行眼斑病和輪斑病病原菌接種，以檢測在病原菌侵染初期果蔗抗病基因同源序列的表達情況。

表 2 3種接種方法在黔糖3號葉片的發(fā)病情況

2.2 果蔗NBS-LRR類抗病基因同源序列表達分析

對賀爾奇等克隆得到的7條果蔗RGAs序列進行核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)7條序列核苷酸的一致性為78.91%，其中4條RGAs（RGA1、RGA2、RGA4和RGA7）的核苷酸序列相似性高達98.95%，彼此間僅有13個位點的差異（圖1，封二）。通過在NCBInr數(shù)據(jù)庫中檢索分析，RGA1、RGA2、RGA4和RGA7與基因AY849870.1的匹配度均為99%，推測它們可能為來源同一基因的不同等位基因片段，命名為RGA1247。RGA3和RGA6則與基因AY849888.1的匹配度分別為99%和98%，因此，也將RGA3和RGA6視為來自同一條基因的片段，命名為RGA36。RGA5與基因AY849871.1的匹配度為99%，為單獨的一條基因片段。

在輪斑病病原菌侵染的最初18 h內(nèi)，3條基因片段在抗病基因型果蔗黔糖5號中的表達水平整體呈“升-降-升”的趨勢（圖2），在感病基因型黔糖3號中的表達水平表現(xiàn)不一致，RGA1247基因片段為“降-升-降”，RGA36基因片段為“升-降-升”，RGA5基因片段表達量在侵染后的6～18 h之間基本無變化?？傮w上看，除RGA5基因片段在病原菌侵染的6 h和18 h兩個時間點在黔糖5號葉片中的表達量略低于黔糖3號外，3條基因片段在抗病基因型黔糖5號中的表達量均高于感病基因型黔糖3號。RGA1247基因片段在6 h表達量最高，12 h時略微降低，RGA36和RGA5基因片段均在12 h時表達量最高，且RGA5的表達量遠遠大于RGA1247和RGA36基因片段。

圖 2 3條果蔗RGAs在輪斑病菌脅迫下的表達情況

在眼斑病病原菌侵染的最初24 h內(nèi)，3條基因片段在兩種果蔗基因型中的表達量如圖3所示。在抗病基因型黔糖5號中，RGA1247和RGA5均表現(xiàn)為“升-降-升”，RGA36表現(xiàn)為“降-升-降-升”；在感病基因型黔糖3號中，RGA1247表現(xiàn)為“降-升”，RGA36和RGA5則表現(xiàn)為“升-降”。在病原菌脅迫的不同時間點上，RGA1247抗病基因片段在黔糖5號中的表達量基本均高于黔糖3號，RGA5基因片段除侵染后6 h時間點未檢測到表達量外，其余時間點的表達量也是在黔糖5號中高，但在侵染的6、12、18 h時間點，RGA36基因片段表現(xiàn)為在感病基因型黔糖3號中的表達量高。RGA1247在0～6 h時間段表達量迅速上升，且在5 h表達量最高，其次為12 h；RGA36 在24 h時間點表達量最高；RGA5在12 h表達量最高。

圖3 3條果蔗RGAs在眼斑病菌脅迫下的表達情況

3 討論

多種植物基于全基因組序列信息挖掘抗病基因的研究表明，NBS類抗病基因在植物基因組中廣泛存在且數(shù)量龐大，如擬南芥中有150個、水稻623個、玉米129個和高粱345個，雖然不同作物之間NBS類基因數(shù)量存在差異，但其差異與基因組的大小并無必然聯(lián)系［13］。面對突然涌現(xiàn)出的這么多抗病基因，如何快速確定各抗病基因在抵御不同病害脅迫中的功能是目前新的挑戰(zhàn)。劉建成利用RT-PCR檢測草莓NBS-LRR基因表達時發(fā)現(xiàn)一個在草莓莖尖和葉片中表達較高的NBS基因片段，對其進行RACE實驗獲得基因全長，并分析該基因?qū)ν庠此畻钏?、脫落酸和茉莉酸甲酯的響?yīng)［31］。宋霄等從蘋果基因組中鑒定出的NBS類基因中選取代表性的基因序列，通過軟件預(yù)測編碼區(qū)并結(jié)合RACE技術(shù)，克隆一個NBS-LRR基因，再進行RT-PCR分析表明該基因的表達可受到蘋果輪紋病病原菌侵染而上調(diào)［32］。本研究通過對目前已獲得的7條果蔗NBS-LRR類同源序列的分析，將其視為來源不同的3條RGAs片段，在眼斑病和輪斑病病原菌的脅迫下，這3條RGAs在果蔗抗病基因型和感病基因型中均表現(xiàn)為不同程度的上調(diào)，說明這3條RGAs確實與眼斑病和輪斑病抗病性相關(guān)。其中，RGA1247對兩種病害的響應(yīng)最為迅速，均在脅迫6 h后表達量上調(diào)至最大，RGA5在兩種病害脅迫后12 h表達量最高，且其表達量遠高于RGA1247和RGA36，尤其對于輪斑病來說，RGA5在脅迫12 h的表達量大約分別是同時間點RGA1247和RGA36表達量的16倍和6倍，因此，RGA5可認為是果蔗在抵御輪斑病和眼斑病侵染初期發(fā)揮主要作用的抗病基因片段，后續(xù)應(yīng)結(jié)合RACE技術(shù)獲得基因全長，做為關(guān)鍵抗病候選基因研究其功能和在外源信號因子作用下的表達情況，全面了解該抗病基因的抗病機理。

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（責任編輯 楊賢智）

Expression analysis of NBS resistance gene analogs from chewing cane under two sugarcane diseases stress

FU Yu-hua，HE Er-oi，LEI Shi-fu，LI Xiang-yong，ZHANG Zheng-xue，LU Jia-ju
（Guizhou Institute of Subtropical Crops，Xingyi 562400，China）

Expression analysis of NBS resistance gene anologs （RGA） from chewing cane under infection of Drechslera sacchari （Butler） Subram. and Jain and Leptosphaeria sacchari Breda de Haan，respectively，were performed in order to provide theoretical basis for cloning disease resistance genes and studying disease resistance mechanism. seven cloned chewing cane RGAs were considered as 3 gene fragments. The 2 pathogenic bacteria were inoculated into leaves of the susceptible genotype QT 3 and the disease resistant genotype QT 5 using needle puncturing method respectively，all 3 chewing cane RGAs were up-regulated in the initial infection. The response of RGA12478 to the two diseases was the most rapid while the expression of RGA5 was the highest. Especially under the infection of L. sacchari，the expression of RGA12478 at 12h was about 16 and 6 times of RGA5 and RGA36 expression at the same time point respectively. Therefore，RGA5 was considered to be a key disease resistance gene fragment from chewing cane playing a major role in resisting the infection of D. sacchari and L. sacchari in the initial infection stage respectively. To study the overall disease resistance mechanism of RGA5，follow-up research should includ cloning the full-length gene using RACE technology，analysis of gene function and expression level under exogenous signal factor treatments.

chewing cane；Drechslera sacchari （Butler） Subram. and Jain；Leptosphaeria sacchari Breda de Haan；resistance gene anologs；expression analysis

S432.2+3

A

1004-874X（2017）02-0118-06

2016-12-04

貴州省科技廳聯(lián)合基金（黔科合J字LKN[2013]03號）；貴州省亞熱帶作物科技創(chuàng)新人才基地建設(shè)經(jīng)費（黔人領(lǐng)發(fā)[2016]22號）

付瑜華（1980-），女，博士，副研究員，E-mail：fufu6699@aliyun.com

付瑜華，賀爾奇，雷石富，等. 2種甘蔗病害脅迫果蔗NBS類抗病基因同源序列的表達分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（2）：118-123.