張秋玲，盧曉丹，鐘燕珊，傅明輝

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510000）

西洋菜鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NoZIP1基因的克隆及表達(dá)研究

張秋玲，盧曉丹，鐘燕珊，傅明輝

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510000）

對(duì)西洋菜鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NoZIP1進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，為研究其在西洋菜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。利用RACE技術(shù)克隆西洋菜NoZIP1基因，用生物信息學(xué)方法分析獲得的基因序列結(jié)構(gòu)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究NoZIP1基因在不同組織及不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)特性。結(jié)果表明，西洋菜NoZIP1基因cDNA全長(zhǎng)1 239 bp，包含完整的閱讀框，編碼356個(gè)氨基酸。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析顯示，NoZIP1基因的表達(dá)在鋅或者鐵脅迫條件下根、葉中均有誘導(dǎo)上調(diào)趨勢(shì)。

西洋菜；鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；RACE；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

鋅和鐵是植物生長(zhǎng)所必需的微量元素，在植物體內(nèi)的許多生化反應(yīng)中起著重要作用［1］。鋅是生物體300多種酶的輔助因子，同時(shí)是生物體內(nèi)重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)輔助因子［2］，不僅參與生物體的各種代謝，在生物膜的穩(wěn)定及基因表達(dá)等生理機(jī)能中也具有重要作用［3］。鐵在細(xì)胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是重要的電子傳遞體。鐵元素在原核和真核生物的生命活動(dòng)中具有不可替代的功能［4］。缺鋅或者缺鐵都會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，但積累過(guò)量的鋅和鐵都會(huì)對(duì)植株造成一定的毒害作用［5-6］。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為適應(yīng)不良環(huán)境脅迫形成了一系列應(yīng)答機(jī)制，這些應(yīng)答反應(yīng)往往通過(guò)植物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)，已發(fā)現(xiàn)一些與鋅鐵吸收和運(yùn)輸有關(guān)的基因在應(yīng)對(duì)鋅鐵脅迫中起重要作用。其中研究較多的是ZIP家族［7］。ZIP家族即鋅調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Zinc-regulated transporter，ZRT）和鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)體（Iron-regulated transporter，IRT），多數(shù)存在于真核細(xì)胞中，植物體內(nèi)的ZIP家族基因可轉(zhuǎn)運(yùn)Cd2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+等多種金屬離子，但不同的ZIP家族成員對(duì)金屬離子作用的特異性不同，對(duì)金屬離子作用的濃度范圍也不同［8-10］。

目前已在擬南芥、水稻、大豆、玉米、苜蓿和番茄等多種植物中發(fā)現(xiàn)了ZIP家族基因［11-15］。研究ZIP基因功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，AtZIP1-4均能轉(zhuǎn)運(yùn)鋅，AtZIP1和AtZIP2還能轉(zhuǎn)運(yùn)銅；而AtIRT1能轉(zhuǎn)運(yùn)鋅、鐵、錳、鎘，其對(duì)Zn2+的轉(zhuǎn)運(yùn)在pH＜4.5時(shí)才具備，AtIRT2能轉(zhuǎn)運(yùn)鋅和鐵，不轉(zhuǎn)運(yùn)錳和鎘［16］。水稻中OsZIP1、OsZIP3、OsZIP4和OsZIP8均具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅的功能，OsZIP1、OsZIP3不能轉(zhuǎn)運(yùn)鐵和錳，OsZIP4不能轉(zhuǎn)運(yùn)鐵［3，12］。苜蓿中MtZIP1、MtZIP5和MtZIP6能轉(zhuǎn)運(yùn)鋅，MtZIP4和MtZIP7能轉(zhuǎn)運(yùn)錳，MtZIP3、MtZIP5和MtZIP6能轉(zhuǎn)運(yùn)鐵［17］。這些都表明ZIP蛋白雖能轉(zhuǎn)運(yùn)多種金屬離子，但很多ZIP蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)離子具有專(zhuān)一性，而目前對(duì)西洋菜中的ZIP家族基因研究較為罕見(jiàn)。西洋菜（Nasturtium officinale R.Br.）又名豆瓣菜，是一種從國(guó)外引進(jìn)的水生蔬菜，在廣東、廣西等省栽培較多，口感嫩脆，深受人們喜愛(ài)，具有一定的食用與藥用價(jià)值［18］。研究表明，西洋菜是一種重要的防癌蔬菜，對(duì)心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)性疾病等慢性疾病也有一定的防御作用［19-20］。我們以西洋菜為材料，利用RACE技術(shù)成功地克隆了完整的鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長(zhǎng)，對(duì)其同源性及相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析方法對(duì)不同環(huán)境條件下該基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究，了解NoZIP1基因的分子特征，為下一步研究其在西洋菜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

西洋菜購(gòu)于廣州大學(xué)城南亭市場(chǎng)。RNA提取試劑、3′RACE試劑盒以及克隆步驟中PCR、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所使用的相關(guān)試劑及大腸桿菌感受態(tài)均購(gòu)自TaKaRa公司，smarter Race試劑盒購(gòu)自Clontech公司，引物合成及基因測(cè)序由上海Introvigen公司完成。

1.2 植物培養(yǎng)與取樣

將西洋菜于砂石基質(zhì)中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為1/2 濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，環(huán)境溫度為25 (± 2）℃，相對(duì)濕度為70(±5 ) %，培養(yǎng)時(shí)間為2～3 d。待西洋菜根系長(zhǎng)出后，進(jìn)行缺鋅處理（原營(yíng)養(yǎng)液去掉Zn源培養(yǎng)）。培養(yǎng)3～4 d后對(duì)根部進(jìn)行取樣，液氮迅速研磨后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 西洋菜根系總RNA的提取

采取Trizol提取法提取西洋菜根系總RNA。取西洋菜根系0.1 g，液氮研磨后，裝入已加1 mL RNAiso Plus裂解液的離心管中，劇烈振蕩30～60 s；加0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；4℃下12 000 g離心15 min；取上清加等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min；4℃下12 000 g離心10 min；小心棄去上清，加1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）上下顛倒混勻，4℃下12 000 g離心5 min；棄上清，干燥RNA，溶于15 μL DEPC水中，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 西洋菜NoZIP1基因的克隆

1.4.1 RT-PCR獲得西洋菜ZIP基因的保守片段 以西洋菜總RNA為模板，Oligo dT為引物合成第一鏈cDNA。在NCBI中找出水稻、玉米、小麥等20多種單子葉被子植物鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列，利用iCODEHOP在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物ZIP1F/ ZIP1R（表1）。以第一鏈cDNA為模板，ZIP1F/ZIP1R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ZIP基因的保守片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

表1 引物序列

1.4.2 西洋菜NoZIP1基因3′端克隆 根據(jù)已獲得的中間片段設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物ZIP2F/ ZIP2R（表1），參照Takara公司3′RACE試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和兩輪巢式PCR擴(kuò)增得到西洋菜NoZIP1基因的3’端。第一輪PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s、64.3℃ 30 s、72℃ 60 s，循環(huán)30次；72℃ 10 min。第二輪PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s、57.7℃ 30 s、72℃ 60 s，循環(huán)30次；72℃ 10 min。

1.4.3 西洋菜NoZIP1基因5′端克隆 根據(jù)已獲得的保守片段及3′端片段設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物ZIP3F/ZIP3R（表1），參照Clontech公司smarter Race試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR擴(kuò)增得到西洋菜NoZIP1基因的5′端。第一輪PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 2 min，循環(huán)5次；94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 2 min，循環(huán)5次；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 2 min，循環(huán)25次。第二輪PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 2 min，循環(huán)5次；94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 2 min，循環(huán)5次；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 2 min，循環(huán)20次。

1.4.4 西洋菜NoZIP1基因cDNA全長(zhǎng)克隆 將克隆得到的中間片段、3′端及5′端用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，獲得西洋菜NoZIP1基因的cDNA全長(zhǎng)序列。用NCBI在線(xiàn)ORF Finder找到該序列的開(kāi)放閱讀框ORF，在ORF兩端設(shè)計(jì)1對(duì)全長(zhǎng)引物ZIP4F/ZIP4R（表1），以cDNA為模板進(jìn)行普通PCR，擴(kuò)增全長(zhǎng)序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s、50.5℃30 s、72℃ 60 s，循環(huán)30次；72℃ 10 min。

1.5 西洋菜NoZIP1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)用PortParam （http：//web.expasy.org/protparam）進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)親疏水性用PortScale （http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pl）分析，用TMHMM Server v.2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜區(qū)分析，信號(hào)肽預(yù)測(cè)用SignalP （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），亞細(xì)胞定位用TargetP（http：//cbs.dtu.dk/services/ TargetP/），NoZIP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)區(qū)域用SMART數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//smart.Embl-heidelberg. De/）分析，利用BLASTX進(jìn)行NCBI蛋白質(zhì)全庫(kù)的相似性搜索（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）。ClustalW2多序列比對(duì)后用Mega7.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)（鄰接法）。

1.6 西洋菜NoZIP1基因的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

對(duì)用1/2 濃度的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)已長(zhǎng)出根系的西洋菜設(shè)置5種處理：缺鋅處理（原營(yíng)養(yǎng)液去掉Zn源培養(yǎng)）、50%鋅處理（去掉原營(yíng)養(yǎng)液一半的Zn源）、缺鐵處理（原營(yíng)養(yǎng)液去掉Fe源）、50%鐵處理（去掉原營(yíng)養(yǎng)液一半的Fe源）、缺Zn & Fe處理（去掉原營(yíng)養(yǎng)液的Zn源和Fe源）。培養(yǎng)4 d并在每天的固定時(shí)間對(duì)根部和葉部進(jìn)行取樣，液氮迅速研磨后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

利用RNA提取試劑盒分別提取根部和葉部不同鹽處理1、2、3、4 d的總RNA，全營(yíng)養(yǎng)處理的西洋菜作為對(duì)照，西洋菜肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)參 （登錄號(hào)為：KX863723）。引物序列為Act-F/Act-R，根據(jù)上述獲得的NoZIP1基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)定量引物G-F/G-R（表1）。按照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒（Takara）操作，兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃ 30 s 進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，95℃ 5 s，51℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，添加熔解曲線(xiàn)程序（從65℃到95℃，每5 s 增加0.5℃并讀取熒光值1次）。反應(yīng)混合液在 Light Cycle 96 熒光定量?jī)x中進(jìn)行反應(yīng)，每個(gè)樣品都設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后獲得NoZIP1基因和內(nèi)參基因Actin在各個(gè)樣品的Ct值 （threshold cycle），按照2-ΔΔCt方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算基因在各個(gè)樣品中的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 西洋菜NoZIP1基因的克隆

克隆西洋菜NoZIP1基因的保守序列、3′端序列及5′端序列，均能擴(kuò)增出750 bp左右的特異片段（圖1），回收特異片段進(jìn)行測(cè)序，分別得到長(zhǎng)度為662、521、475 bp的序列。

用DNAMAN軟件將得到的保守片段、3′端序列及5′端序列去掉重復(fù)片段后進(jìn)行拼接，獲得西洋菜NoZIP1基因的cDNA全長(zhǎng)序列。同時(shí)在該序列開(kāi)放閱讀框的兩端設(shè)計(jì)引物（ZIP-2F/ZIP-2R），擴(kuò)增出一條1 087 bp的特異片段（圖1）。將該片段進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與拼接結(jié)果完全相同。序列提交NCBI獲得序列登陸號(hào)為KX858826。

圖1 電泳結(jié)果

2.2 西洋菜NoZIP1蛋白的生物信息學(xué)分析

對(duì)西洋菜NoZIP1基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該序列全長(zhǎng)1 239 bp，包括一個(gè)完整的閱讀框，含有1 071 bp核苷酸，共編碼356個(gè)氨基酸；5′和3′端非編碼序列長(zhǎng)度分別為53 bp和115 bp。使用Portparam分析西洋菜NoZIP1基因編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該序列的分子量為38.116 ku，理論等電點(diǎn)為6.45，總負(fù)電荷殘基數(shù)目為27，總正電荷殘基數(shù)目為23，分子式為C1705H2701N449O483S28，不穩(wěn)定指數(shù)為37.49，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為102.25。利用在線(xiàn)工具對(duì)NoZIP1基因亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白的分泌途徑為S型，即定位在分泌通路，預(yù)測(cè)剪切位點(diǎn)序列為27個(gè)氨基酸。用在線(xiàn)工具PortScale對(duì)西洋菜NoZIP1基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析，窗口大小選擇9，結(jié)果表明（圖 2），該蛋白在N端、C端、跨膜區(qū)都存在明顯的疏水區(qū)。用ProtParam tool 分析該蛋白氨基酸的平均疏水系數(shù)為 0.477，說(shuō)明該蛋白為疏水蛋白。

圖2 NoZIP1蛋白的親水性/疏水性分析

用TMHMM Server對(duì)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3，封二）顯示，該蛋白含有9個(gè)跨膜區(qū)（5～27、53～72、85～107、127～149、200～222、232～254、261～283、298～320、332～354），跨膜區(qū)的長(zhǎng)度均為22個(gè)氨基酸殘基。表明該蛋白可能是一種跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?。用在線(xiàn)工具SignalP對(duì)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明NoZIP1蛋白含有信號(hào)肽，可能在跨膜運(yùn)輸中起信號(hào)識(shí)別作用，剪切位點(diǎn)位于第27～28位氨基酸之間。用在線(xiàn)工具SMART和InterProScan對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，NoZIP1蛋白第49～353位之間是個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域，即ZIP家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域。同時(shí)利用Portfun 2.2 server對(duì)NoZIP1蛋白的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，NoZIP1蛋白參與金屬離子運(yùn)輸和調(diào)控過(guò)程的功能概率最高為 0.773，說(shuō)明NoZIP1蛋白在機(jī)體內(nèi)可能有轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+、Fe2+的功能。

2.3 西洋菜NoZIP1蛋白與其他ZIP類(lèi)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及相似性分析

根據(jù)NoZIP1序列推導(dǎo)出的氨基酸序列在NCBI中Blast P的比對(duì)結(jié)果，選取蛋白序列同源性相對(duì)較高的薺藍(lán)（Camelina sativa L.，XP_010499439.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana Thal.，NP_187881.1）、木豆（Cajanus cajan L.，KYP36079.1）、鷹嘴豆（Cicer arietinum L.，XP_004488546.1）、野生大豆（Glycine soja Sieb.et Zucc.，KHN21378.1）、中棉（Gossypium raimondii UIbr.，XP_ 012463602.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum L.，XP_016706618.1）、川桑（Morus notabilis Schneid.，XP_010109875.1）、梅花（Prunus mume Sieb.，XP_008226052.2）、蓖麻（Ricinus communis L.，XP_002532140.1）、可可樹(shù)（Theobroma cacao L.，XP_007022739.1）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana Chod.，XP_010544345.1）、油菜（Brassica napus L.，XP_013586854.1）、綠豆（Vigna radiate L.，XP_014501490.1）、蘋(píng)果（Malus domestica Mill.，XP_008371921.1）、大豆（Glycine max L.，XP_003531480.1）等16種植物ZIP基因的氨基酸序列與西洋菜NoZIP1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。其中西洋菜與薺藍(lán)、擬南芥、油菜、醉蝶花的氨基酸序列相似性高達(dá)66%～90%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果（圖4A）表明，西洋菜NoZIP1基因編碼蛋白與擬南芥、薺藍(lán)、醉蝶花的親緣關(guān)系較近，與川桑、蓖麻、梅花等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且該蛋白分子進(jìn)化歷程與物種進(jìn)化歷程一致。同時(shí)下載具有代表性的擬南芥ZIP家族蛋白氨基酸序列AtZIP1～12及AtIRT1～3，使用MEGA7軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖4B）顯示，NoZIP1蛋白與AtZIP1聚成一個(gè)分支，表明兩者親緣關(guān)系較近。

圖4 NoZIP1基因與其他植物ZIP基因氨基酸進(jìn)化樹(shù)分析

2.4 西洋菜NoZIP1基因在不同組織中的表達(dá)情況

西洋菜NoZIP1基因在不同組織、不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)情況見(jiàn)圖5和圖6。對(duì)圖5、圖6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，同一種處理下不同天數(shù)的相對(duì)表達(dá)量數(shù)值間P值均小于0.001，說(shuō)明各處理?xiàng)l件下不同天數(shù)的表達(dá)量具有顯著性差異。從圖5、圖6可看出，NoZIP1基因在西洋菜根部和葉部的表達(dá)量總體均為先下降后上升，但根部表達(dá)量下降更快，第1天即較對(duì)照有較大幅度的下降，說(shuō)明根部對(duì)缺營(yíng)養(yǎng)素的響應(yīng)比較迅速。根部中，表達(dá)量下降持續(xù)的時(shí)間為1～2 d，一般是從第2天開(kāi)始表達(dá)量出現(xiàn)誘導(dǎo)上升并達(dá)到最大值。而雙缺和缺鐵條件下表達(dá)量最大值出現(xiàn)在第3天，較其他條件稍晚，但缺鐵條件下的表達(dá)量上升非常顯著。葉部中，表達(dá)量下降持續(xù)時(shí)間為2～3 d，比根部稍長(zhǎng)，一般從第4天開(kāi)始上升。綜上說(shuō)明，NoZIP1基因在根部和葉部均能受缺營(yíng)養(yǎng)素的影響而誘導(dǎo)表達(dá)，只是在不同組織中出現(xiàn)誘導(dǎo)的時(shí)間存在差異。

圖5 NoZIP1在根部不同條件下的相對(duì)表達(dá)量分析

圖6 NoZIP1在葉部不同條件下的相對(duì)表達(dá)量分析

3 結(jié)論與討論

本研究利用RACE技術(shù)成功克隆出1 條ZIP全長(zhǎng)基因，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)分析暫命名為NoZIP1。利用生物信息學(xué)方法分析，NoZIP1 蛋白具有9個(gè)跨膜域，1個(gè)信號(hào)肽序列（1～26）和1個(gè)ZIP家族特征序列（49～353），具有跨膜運(yùn)輸活性和陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體結(jié)合位點(diǎn)，在 N 端、C 端、及跨膜區(qū)均存在明顯的疏水區(qū)，因此推測(cè)NoZIP1蛋白為跨膜運(yùn)輸?shù)鞍?。?shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，NoZIP1基因在根部和葉部均受誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)能夠響應(yīng)外界鋅離子和鐵離子濃度變化。

西洋菜是一種具有一定藥用價(jià)值的可食用蔬菜，也是一種可對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)行修復(fù)的蔬菜［21］，在惡劣生長(zhǎng)環(huán)境下也能生長(zhǎng)良好，體內(nèi)有一套對(duì)不同環(huán)境脅迫的應(yīng)答機(jī)制。植物體內(nèi)對(duì)鋅、鐵的吸收，運(yùn)輸，分配及維持細(xì)胞內(nèi)鋅鐵離子的平衡穩(wěn)定離不開(kāi)一些蛋白家族的協(xié)同作用。與鋅鐵吸收的蛋白家族主要有ZIP家族、黃色條紋蛋白家族（yellow stripe-like，YSL）、自然抗性相關(guān)巨噬蛋白家族（The natural resistance associated macrophage protein，NRAMP）及陽(yáng)離子擴(kuò)散輔助蛋白家族（Cation diffusion facilitator protien，CDF）等［22］。對(duì)ZIP家族功能結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含8個(gè)跨膜區(qū)及相似的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，等電點(diǎn)在5～9.28之間，不穩(wěn)定系數(shù)為27～44，ZIP蛋白長(zhǎng)度為226～459個(gè)氨基酸，氨基酸數(shù)目的不同主要是因?yàn)棰蟆ⅱ艨缒^(qū)間的“可變區(qū)”長(zhǎng)度不同。一般認(rèn)為，可變區(qū)位于胞內(nèi)，且富含組氨酸殘基，可能與金屬離子的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)［23-24］。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)西洋菜NoZIP1蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，西洋菜NoZIP1蛋白具有ZIP家族基因的一些基本特征，且在第49～353位氨基酸之間有ZIP家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域，因此推斷NoZIP1是ZIP家族成員之一。在用NCBI的Blast P進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，NoZIP1與其他16種植物的ZIP1蛋白相似性達(dá)57%～90%，故將本研究中克隆得到的基因暫命名為NoZIP1。在進(jìn)行系統(tǒng)分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建時(shí)發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子進(jìn)化歷程與物種進(jìn)化歷程一致，同一分支中均為雙子葉植物。與擬南芥ZIP家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果中顯示，NoZIP與AtZIP1屬同一分支，親緣關(guān)系最近，且西洋菜本身也屬于南芥族，故推測(cè)NoZIP1與AtZIP1可能具有相似的功能。

在對(duì)ZIP蛋白表達(dá)情況的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，ZIP家族成員編碼的基因在許多植物的各個(gè)不同器官中（籽粒、花、根、莖、根瘤）都有表達(dá)，但表達(dá)模式呈現(xiàn)一定的差異性［25］。目前已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了16個(gè)ZIP家族基因，且AtIRT1是最早被發(fā)現(xiàn)的ZIP 家族成員，主要在根部表達(dá)［26-28］。研究發(fā)現(xiàn)，AtZIP1、AtZIP5、AtZIP9 和AtZIP12受缺鋅誘導(dǎo)表達(dá)［29］，說(shuō)明這些基因在缺鋅條件下可能增強(qiáng)對(duì)鋅的吸收。對(duì)水稻中的ZIP家族成員進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，OsZIP1、OsZIP3、OsZIP8在根部和地上部中均受缺鋅誘導(dǎo)表達(dá)，其中OsZIP1在根部的表達(dá)量比地上部高，OsZIP7a在根部缺鐵誘導(dǎo)，OsZIP8在缺鐵時(shí)根和葉中的表達(dá)量均不高［30-31］。López-Millón等［17］從苜蓿中分離得到了MtZIP1和MtZIP3-7，半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，對(duì)苜蓿進(jìn)行缺鋅處理時(shí)，MtZIP1在苜蓿的根和葉中都表達(dá)，MtZIP3 和MtZIP4在根和葉中表現(xiàn)為誘導(dǎo)表達(dá)，而MtZIP6和 MtZIP7沒(méi)有顯著變化。本研究中NoZIP1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，在缺營(yíng)養(yǎng)素的條件下，NoZIP1在根部與葉部均受誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)情況具有一定差異。根部和葉部NoZIP1的表達(dá)趨勢(shì)基本都是先下降后上升，可能是植物對(duì)初遇不良環(huán)境表現(xiàn)出的應(yīng)答機(jī)制。缺營(yíng)養(yǎng)素條件下，植物生長(zhǎng)生理受到影響，基因表達(dá)降低。之后啟動(dòng)自身防御機(jī)制，表達(dá)一些基因?qū)共焕麠l件，因此出現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。但植物根部和葉部出現(xiàn)這樣趨勢(shì)的時(shí)間有一定差

異，根部NoZIP1基因表達(dá)量下降得更為顯著，尤其在雙缺或缺鐵的條件下。為對(duì)抗此兩種不利條件，誘導(dǎo)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)所需時(shí)間也要稍長(zhǎng)，表現(xiàn)為其他缺營(yíng)養(yǎng)素條件下都是第2天表達(dá)量開(kāi)始上升且達(dá)到最大值，雙缺和缺鐵條件下，此變化出現(xiàn)在第3天。而缺鋅或50%缺鐵條件對(duì)植物的脅迫壓力較雙缺和缺鐵稍小，因此植物對(duì)抗不利條件誘導(dǎo)鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)所需的時(shí)間也相對(duì)較短。后期即第4天開(kāi)始植物整體的生長(zhǎng)生理代謝受損，導(dǎo)致整體基因表達(dá)量出現(xiàn)下降。葉部對(duì)缺鋅鐵的脅迫反應(yīng)響應(yīng)速度較根部稍慢，表現(xiàn)在脅迫導(dǎo)致的基因表達(dá)量下降的較為緩慢。由于脅迫信號(hào)需從根部傳遞上來(lái)，因此葉部的響應(yīng)速度比根部慢，對(duì)抗不利條件誘導(dǎo)基因表達(dá)也出現(xiàn)得比根部慢。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Cloning and expression analysis of NoZIP1 gene in Nasturtium officinale R. Br.

ZHANG Qiu-ling，LU Xiao-dan，ZHONG Yan-shan，F(xiàn)U Ming-hui
（School of Chemical Engineering and Light Industry， Guangdong University of Technology，Guangzhou 510000，China）

To contribute to the further functional determination of the gene involving growth and development of Nasturtium officinale R. Br.，ZIP1 gene was cloned according to homologous gene conserved region by RACE method. Its sequences and expression characters were examined by bioinformatics and real-time PCR，respectively. The full-length cDNA was 1 239 bp and it encoded a polypeptide of 356 amino acids with an entire ORF. It had high similarity to ZIP proteins of other plants. By real-time PCR approach，it was found that the expression of NoZIP1 was significantly induced both in roots and shoots by zinc-deficiency or iron-deficiency.

Nasturtium officinale R.Br.；ZIP （Zrt，Irt like Protein）；RACE；real-time PCR

Q786

A

1004-874X（2017）02-0039-10

2016-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（21177029）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016A010105020）

張秋玲（1992-），女，在讀碩士生，E-mail：qiuling92@163.com

傅明輝（1967-），女，博士，教授，E-mail：mhfugd@126.com

張秋玲，盧曉丹，鐘燕珊，等. 西洋菜鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NoZIP1基因的克隆及表達(dá)研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44 （2）：39-48.