程紅，隋秀芳*

（黔東南州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測所，貴州凱里556000）

酶解法提取藍(lán)莓果汁的研究

程紅，隋秀芳*

（黔東南州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測所，貴州凱里556000）

為提高藍(lán)莓果汁的提取率和營養(yǎng)品質(zhì)，利用酶解技術(shù)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗優(yōu)化酶解工藝條件，并對果汁出汁率、總可溶性固形物、花青素含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，酶解法提取藍(lán)莓果汁最優(yōu)工藝條件為果膠酶∶纖維素酶=3∶1，酶用量0.20%，酶解時間180 min，酶解溫度50℃。在此最佳酶解工藝條件下，藍(lán)莓果汁出汁率為73.37%，總可溶性固形物含量為11.8°Bx，花青素含量為300.7 mg/kg。

藍(lán)莓果汁；出汁率；酶解；總可溶性固形物；花青素

藍(lán)莓（blueberry）學(xué)名越桔，屬于杜鵑花科越桔屬植物。藍(lán)莓的果實中含有豐富的花色苷（花青素），主要有抗生素、抗自由基、抗視力退化、抗動脈硬化和血栓形成的作用[1]。藍(lán)莓可100%鮮食，也可加工成果汁飲料、果酒飲品等。

由于藍(lán)莓屬于小漿果類，生長季節(jié)性強(qiáng)，收獲期集中，采后不耐儲存，故將鮮果加工成果汁是有效的解決途徑之一。但由于藍(lán)莓果實富含果膠等黏性物質(zhì)，影響出汁率且易使汁液渾濁，降低果汁品質(zhì)[2]。果汁提取方法報道較多，主要有冷提取法、熱提取法、生物酶解法等。其中生物酶解法利用酶催化反應(yīng)可有效提高果汁出汁率和澄清度[3-5]。李長春等[6-7]研究表明，補(bǔ)充纖維素酶以協(xié)同、促進(jìn)果膠酶作用，可以顯著提高水果出汁率。本研究以果膠酶纖維素酶對藍(lán)莓果漿進(jìn)行酶解，選擇單因素及正交試驗分析方法，研究復(fù)合酶比例、酶用量、酶解溫度、酶解時間對出汁率、總可溶性固形物（totalsoluble solid，TSS）含量的影響，并測定其花青素含量，從而確定酶解法提取藍(lán)莓果汁的適宜工藝條件，以期為藍(lán)莓果的深加工提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮藍(lán)莓果：產(chǎn)于貴州省麻江縣，挑選新鮮、充分成熟、無霉變果，清洗瀝干水分，聚乙烯薄膜包裝后于-18℃冰柜冷凍貯藏備用。

果膠酶（酶活1000U/mg）、纖維素酶（酶活1800U/mg）：鄭州超凡化工有限公司；飛燕草色素（純度≥96%）、矢車菊色素（純度≥98%）、矮牽牛色素（純度≥96%）、天竺葵色素（純度≥96%）、芍藥素（純度≥98%）、錦葵色素（純度≥96%）：上海同田生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ1000電子天平：美國雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司；TDL-5低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WAY-2S型阿貝折射儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-360A超聲波清洗器：上海之信儀器有限公司；Agilent 1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物酶解法提取藍(lán)莓果汁工藝流程[8]

新鮮藍(lán)莓原料→解凍→打漿→酶處理→壓榨、過濾

從冰柜中取出藍(lán)莓凍果，在冰箱4℃環(huán)境中解凍，用破碎機(jī)將藍(lán)莓果打漿。稱取100 g藍(lán)莓果漿按照酶解條件進(jìn)行酶解處理。酶解處理過程中用保鮮膜密封反應(yīng)容器，防止水分蒸發(fā)；酶解后迅速用冷水降到室溫。用兩層紗布過濾，除掉粗纖維及果渣，取汁。以藍(lán)莓果打漿后未加酶直接進(jìn)行壓榨過濾的藍(lán)莓果汁作為對照組。

1.3.2 酶解工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，以出汁率和總可溶性固形物含量為評價指標(biāo)，對影響果汁酶解效果主要因素即酶用量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、復(fù)合酶比例（1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）、酶解時間（60min、90 min、120 min、150 min、180 min）和酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）進(jìn)行分析。

（2）正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取酶用量（A）、果膠酶與纖維素酶比例（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）4個影響因素，采用L9（34）正交試驗設(shè)計，以出汁率和總可溶性固形物含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗，因素與水平見表1。

表1 酶解工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymolysis process optimization

1.3.2 測定指標(biāo)與方法

出汁率的計算公式如下：

總可溶性固形物含量的測定：采用阿貝折射儀。

花青素的測定采用高效液相色譜法：分別配制飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥素和錦葵色素共6種花青素單標(biāo)儲備液，將單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行混合，用10%鹽酸甲醇溶液作為溶劑，逐級稀釋成0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、25.0 mg/L、50 mg/L的花青素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，進(jìn)行高效液相色譜分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取酶解果汁和對照組（即未處理樣）5.00g左右于50mL具塞比色管中，加入提取液定容，搖勻1 min后，超聲提取30 min。超聲提取后，于沸水浴中水解1h，取出冷卻后，用提取液定容。靜置，取上清液過膜待測。

高效液相色譜條件：C18色譜柱（250mm×4.6mm×5μm）；流動相A為含1%甲酸水溶液，流動相B為含1%甲酸乙腈溶液；檢測波長：530nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL；梯度洗脫條件參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T2640—2014《植物源性食品中花青素的測定高效液相色譜法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解條件優(yōu)化試驗結(jié)果

圖1 酶用量(A)、果膠酶與纖維素酶比例(B)、酶解時間(C)及酶解溫度(D)對藍(lán)莓汁提取的影響Fig.1 Effects of enzyme addition(A),ratio of pectinase and cellulase(B),enzymolysis time(C)and temperature(D) on blueberry juice extraction

由圖1A可知，隨著酶用量的增加，出汁率、總可溶性固形物含量也隨之增加。在加酶量＜0.2%時，兩者值增加較明顯。加酶量＞0.2%后，兩者值增幅很小。因為在一定條件下，加酶量低于最佳值時，酶解未進(jìn)行完全；達(dá)到最佳值時，酶解進(jìn)行的較徹底[9-10]，過多的添加酶只是加快酶解速度，不能提高產(chǎn)量，結(jié)合生產(chǎn)成本分析，選定酶用量為0.2%。

由圖1B可知，當(dāng)果膠酶∶纖維素酶為1∶1～3∶1時，出汁率與總可溶性固形物含量隨果膠酶的增加而增大；當(dāng)果膠酶∶纖維素酶為3∶1時，出汁率與總可溶性固形物含量最高；當(dāng)果膠酶∶纖維素酶＞3∶1之后，出汁率與總可溶性固形物含量隨果膠酶的增加而下降。故選擇復(fù)合酶配比3∶1為宜。

由圖1C可知，當(dāng)酶解時間為50～180 min時，隨著酶解時間的延長，出汁率呈先增加后降低的趨勢，可溶性固形物含量呈增長趨勢；當(dāng)酶解時間為150 min時，出汁率為42.42%，可溶性固形物含量為11.3°Bx?？紤]果汁長時間在較高溫度下處理會導(dǎo)致出汁率降低，營養(yǎng)流失，故選擇酶解時間為150 min。

由圖1D可知，當(dāng)酶解溫度為30～50℃時，隨著酶解溫度的升高，出汁率、總可溶性固形物含量也隨之增加；當(dāng)酶解溫度達(dá)到50℃時，出汁率、總可溶性固形物含量達(dá)到最大值；當(dāng)酶解溫度＞50℃，出汁率反而下降，總可溶性固形物含量在酶解溫度＞60℃以后也下降。分析原因，果汁長時間在較高溫度下，水分蒸發(fā)快，導(dǎo)致出汁率下降；過高的溫度會使果膠酶纖維素酶失活，影響酶解效率；高溫會分解果汁中碳水化合物，導(dǎo)致可溶性固形物含量下降[11-13]。故酶解溫度選擇50℃為宜。

2.2 正交試驗結(jié)果及方差分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取酶用量（A）、果膠酶：纖維素酶（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）4個影響因素，以出汁率和總可溶性固形物含量為考察指標(biāo)，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 酶解工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for enzymolysis process optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，以出汁率為評價指標(biāo)，4個因素的影響程度順序為C＞B＞A＞D，即對出汁率影響最大的是酶解時間，依次是果膠酶∶纖維素酶、酶用量、酶解溫度，最佳組合為A2B2C3D2。以總可溶性固形物含量為評價指標(biāo)，4個因素的影響程度順序為A＞D＞B＞C，即對總可溶性固形物含量影響最大的是酶用量，其次是酶解溫度、果膠酶∶纖維素酶、酶解時間，最佳組合為A3B1C3D3。按照兩組最佳組合分別進(jìn)行3組驗證試驗，出汁率分別為69.77%和73.37%，總可溶性固形物含量分別為11.7°Bx和11.8°Bx。綜合考慮，最佳組合為A2B2C3D2，即酶用量0.2%，果膠酶∶纖維素酶為3∶1，酶解時間180 min，酶解溫度50℃。

由表3可知，修正模型的P＜0.05，說明正交試驗方差分析模型是適用的，酶用量、果膠酶：纖維素酶、酶解時間、酶解溫度對出汁率和總可溶性固形物含量的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

2.3 花青素含量測定結(jié)果

按照最優(yōu)組合，即酶用量0.2%，果膠酶∶纖維素酶為3∶1，酶解時間150 min，酶解溫度55℃處理藍(lán)莓，得到酶解果汁，同對照組分別進(jìn)行花青素含量分析，標(biāo)準(zhǔn)溶液、對照品及樣品高效液相色譜圖結(jié)果見圖2～圖4。

由圖2可知，6種花青素標(biāo)準(zhǔn)品分離效果較好，出峰時間分別為：飛燕草色素8.941 min、矢車菊素10.497 min、矮牽牛色素13.801 min、天竺葵色素16.355 min、芍藥素16.889 min、錦葵色素17.034 min。

圖2 花青素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of anthocyanidins mixed standard solution

圖3 對照組花青素高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of anthocyanidins control group

由圖3可知，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時間定性，對照組含有矢車菊素（10.495 min）、矮牽牛色素（13.842 min）、芍藥素（16.905 min）和錦葵色素（17.042 min）。飛燕草色素和天竺葵色素均未檢出。

圖4 酶解藍(lán)莓果汁花青素高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of anthocyanidins in enzymolysis blueberry juice

由圖4可知，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時間定性，酶解藍(lán)莓果汁中含有矢車菊素（10.492 min）、矮牽牛色素（13.840 min）、芍藥素（16.903 min）和錦葵色素（17.028 min）。飛燕草色素和天竺葵色素均未檢出。

此外，圖3與圖4中出峰時間在13.19 min左右所對應(yīng)的化合物可能是另一種花青素，對其定性定量還有待進(jìn)一步研究。李穎暢[14]研究表明藍(lán)莓含有17種花色苷單體，包含飛燕草色素不包含天竺葵色素，不同于本實驗結(jié)論。原因在于花青素的種類與含量受藍(lán)莓果實的品種、成熟時間等影響，存在一定的差異。各個花青素含量計算結(jié)果見表4。

表4 藍(lán)莓汁中花青素含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of anthocyanidins content in blueberry juicemg/kg

由表4可知，酶解果汁各個花青素含量均高于對照組。根據(jù)花青素含量計算要求，樣品中花青素含量為6種花青素含量之和，得出藍(lán)莓果汁中花青素含量。酶解果汁花青素含量高出對照組99.3 mg/kg，提升了藍(lán)莓果汁中花青素的含量。原因在于果膠酶和纖維素酶的加入有助于藍(lán)莓果皮細(xì)胞壁的分解，使得果皮中花色苷等物質(zhì)溶于果汁中，經(jīng)水解形成花青素[15-17]。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗探討了復(fù)合酶比例、酶用量、酶解時間和酶解溫度對藍(lán)莓果汁出汁率和總可溶性固形物含量的影響，優(yōu)化出最佳酶解工藝為果膠酶：纖維素酶=3∶1，酶用量0.20%，酶解時間180 min，酶解溫度50℃。按照最佳酶解工藝參數(shù)制得藍(lán)莓果汁出汁率為73.37%，總可溶性固形物含量為11.8°Bx。

對酶解前后藍(lán)莓果汁進(jìn)行花青素含量分析得出，藍(lán)莓果汁中含有矢車菊素、矮牽牛色素、芍藥素和錦葵色素，飛燕草色素和天竺葵色素均未檢出；酶解后藍(lán)莓果汁花青素含量300.7 mg/kg，高于對照組中花青素含量201.4 mg/kg。

結(jié)果說明酶解法提取藍(lán)莓果汁不僅能顯著提高出汁率，而且可以進(jìn)一步提升果汁營養(yǎng)價值，適宜在實際生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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Research on the extraction of blueberry juice by enzymolysis method

CHENG Hong,SUI Xiufang*
(Institute of Quality and Technology Supervision of Qiandongnan,Kaili 556000,China)

In order to improve the extraction rate and nutritional quality of blueberry juice,using enzymatic hydrolysis technology,on the basis of single factor experiments,the enzymolysis conditions were optimized by orthogonal experiments,and the juice yield,total soluble solid(TSS)and anthocyanidins content were determinated.The results showed that the optimum enzymolysis extraction process conditions of blueberry juice were pectinase∶cellulase 3∶1,enzyme addition 0.20%,enzymolysis time 180 min,temperature 50℃.Under the optimum extraction process conditions,the juice yield of blueberry juice was 73.37%,the contents of TSS and anthocyanidins were 11.8°Bx and 300.7 mg/kg,respectively.

blueberry juice;juice yield;enzymolysis;total soluble solid;anthocyanidins

TS264.2

0254-5071（2017）04-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.032

2016-12-12

貴州省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)項目（黔科合SY字[2013]3115號）

程紅（1968-），女，高級工程師，本科，研究方向為食品加工與安全。

*通訊作者：隋秀芳（1987-），女，工程師，碩士，研究方向為食品加工與安全。