喬傳麗，蔣彩虹，金丹，蔣艾廷，盧士玲，李王強，李寶坤*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中酵母菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

喬傳麗，蔣彩虹，金丹，蔣艾廷，盧士玲，李王強，李寶坤*

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

從新疆塔城地區(qū)哈薩克族不同牧場家庭中自然發(fā)酵牛乳采集18份樣品，從中分離篩選得到47株酵母菌，并進行形態(tài)鑒定、生理生化鑒定、聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE），26S rDNA分子生物學(xué)鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，47株菌中包括庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）18株，阿薩希絲孢酵母菌（Trichosporon asahii）10株，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）7株，絲孢酵母（Trichosporon coremiiforme）4株，馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）4株，東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）2株，發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）1株，近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）1株。鑒定結(jié)果對進一步認識并利用哈薩克族傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中酵母菌資源具有重要意義。

傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶；26S rDNA D1/D2；篩選；分離鑒定；聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳

傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品是以鮮奶為原料，經(jīng)乳酸菌、酵母菌等發(fā)酵而成，是天然的綠色產(chǎn)品，其微生物資源豐富，營養(yǎng)價值高，并具有較好的益生作用。新疆少數(shù)民族多年以來一直保留著傳統(tǒng)方法制作發(fā)酵乳制品的習(xí)慣，為發(fā)掘有益微生物提供了寶貴的資源[1]。閆彬[2]的研究中顯示酵母菌單獨發(fā)酵時的乙醇含量明顯高于酵母和乳酸菌混菌發(fā)酵，可以看出酸乳中的醇香主要由酵母菌產(chǎn)生。張敏等[3]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酵母菌發(fā)酵后半胱氨酸（Cys）和色氨酸（Ser）在乳清中含量增加，有助于血脂的降低。陳成等[4]研究發(fā)現(xiàn)克魯維酵母在發(fā)酵時產(chǎn)生乳糖酶分解乳糖來緩解全球各類人群的乳糖不耐癥。但是，目前新疆酸奶中酵母菌資源的開發(fā)和利用還存在著不足之處，傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中對酵母菌的研究相對乳酸菌較少，因此對傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中酵母菌資源的收集、分離鑒定和生物學(xué)特性的研究是其開發(fā)利用的基礎(chǔ)。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，DGGE技術(shù)被越來越多的專家學(xué)者應(yīng)用于分析復(fù)雜微生物群落多樣性。DGGE技術(shù)既可以用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品衛(wèi)生的菌群結(jié)構(gòu)分析也可以用于純菌株的分離和篩選，減少分子和生化鑒定的數(shù)量，具有快速可靠的特點[5-6]。GKATZIONIS K等[7]利用聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturinggradientgelelectrophoresis，PCR-DGGE）和限制性片段長度多態(tài)性（terminalrestrictionfragmentlength polymorphism，TRFLP）技術(shù)對斯第爾頓奶酪不同部分酵母菌多樣性和活性進行研究。因此，該試驗結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術(shù)對傳統(tǒng)乳制品中酵母菌多樣性進行研究。以新疆塔城牧區(qū)哈薩克族普通農(nóng)戶不同家庭自制酸奶為原料，利用傳統(tǒng)分離方法初步分離出具有酵母菌特性的菌株，再利用PCR-DGGE法剔除重復(fù)菌種及測序比對來分析新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中酵母菌的優(yōu)勢菌群和生物多樣性。此研究不僅為新疆塔城地區(qū)傳統(tǒng)酸奶中酵母菌菌株資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)培養(yǎng)了優(yōu)勢菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

從新疆塔城地區(qū)哈薩克族牧民家庭中采集18份酸奶樣品。采集的酸奶裝于滅菌的離心管內(nèi)，密封后放入車載冰箱于4℃運回實驗室，即進行后續(xù)試驗。

1.1.2 試劑

酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、2×Taq PCR MasterMix：天根生化科技有限公司；EB核染色劑：北京索萊寶科技有限公司；引物NL1和NL4：上海生物工程有限公司。2%美蘭、林格氏碘液、丙烯酰胺/雙丙烯酰胺（37.5∶1）濃度為8%、50×TAE緩沖液。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g。

碳源培養(yǎng)基：碳源0.5%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.01%，氯化鈉0.01%，酵母粉0.02%。

氮源培養(yǎng)基：氮源0.07%，葡萄糖2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，酵母粉0.02%。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備公司；5417R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；TC-512PCR擴增儀：Techne公司；DM3000熒光電子顯微鏡：Lecia公司；LD2X-40II電熱蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DGGE電泳分析系統(tǒng)：INGENY公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

吸取1 mL傳統(tǒng)酸奶樣品于滅菌的酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）液體培養(yǎng)基中，28℃進行48 h富集培養(yǎng)，連續(xù)富集培養(yǎng)2代后吸取1 mL富集培養(yǎng)液于9 mL無菌生理鹽水試管中，漩渦均勻。將混合后的樣液進行梯度稀釋，選取10-4、10-5、10-63個稀釋度，用移液器吸取150 μL樣液，采用涂布法，將樣液均勻涂布于YPD培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀察并記錄菌落特征并挑取不同形態(tài)單個菌落，進行簡單染色，觀察細胞形態(tài)，將類似酵母菌菌株接種于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將酵母菌重復(fù)劃線幾次，進行鏡檢，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后進行菌種保存。其中，保存液與菌液分別為700μL、600μL，存入1.5 mL離心管，標(biāo)記后放入-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酵母菌的生理生化特性鑒定

將分離菌株接種于固體YPD培養(yǎng)基，置28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。酵母菌分離菌株主要通過繁殖方式觀察、碳源同化試驗、氮源同化試驗、產(chǎn)酸試驗等生理生化特征進行鑒定。

1.3.3 酵母菌的26S rDNA分析

（1）酵母基因組總DNA的提取

吸取1 mL菌懸液，12 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書上的方法進行提取DNA。將提取到的基因組DNA轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL EP管中，做好編號，放于-20℃冰柜保藏備用。

（2）酵母PCR擴增及擴增產(chǎn)物的檢測

將制備的基因組DNA作為PCR擴增的模板，PCR擴增目的片段引物序列為：NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGA GGAAAAG-3'），NL4（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）。PCR-DGGE擴增引物，上游引物為NL1GC（5'＞GCG GGC CGCGCGACCGCCGGGACGCGCGAGCCGGCGGCG GGC CAT ATC AAT AAG CGG AGG AAA AG＜3'），下游引物為LS2（5'＞ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC＜3'）引物擴增的目的片段大小在300～700 bp之間，上述引物均由上海生工合成提供。PCR采用50 μL體系：2×Master Mix25μL，NL1和NL4（10μmol/L）各2 μL，DNA模板2 μL，去離子水50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)（94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min），72℃延伸10 min。預(yù)先制備的1%的瓊脂糖凝膠，擴增反應(yīng)完畢后，取5 μL的PCR擴增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電壓100 V，電泳液為1×TAE。電泳后用EB染色20 min，紫外燈下觀察，目的條帶為300～700 bp范圍內(nèi)出現(xiàn)明亮的條帶，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）變性梯度凝膠電泳（DGGE）剔除重復(fù)菌株

變形梯度凝膠電泳系統(tǒng)分析，變性梯度從30%～50%，試驗之前先將DGGE儀200V、60℃預(yù)熱30min，然后在85V的固定電壓下電泳12～14 h。待DGGE完以后，將膠取出放置在超純水（含0.5 μL/mL EB）中搖床染色30 min，20 min脫色3～4次后在凝膠成像儀上分析。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育及同源性分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測合格后，送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行測序，測序得到的26S rDNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)（http：//www.ncb.nlm.nih. gov/Blast/）進行同源序列搜索，從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)種屬的26SrDNA基因序列，采用軟件Mega5.0中的Neighbor-Joining方法與標(biāo)準菌株基因序列進行比對，進行1 000次Bootstrap檢驗后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)特征

從新疆塔城地區(qū)哈薩克族18份傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶樣品中分離得到的47株酵母菌菌株，劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，菌落形態(tài)見圖1，美蘭染色結(jié)果見圖2。

圖1 酵母菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of yeast strains

圖2 酵母菌美蘭染色結(jié)果（10×100）Fig.2 Methylene blue staining results of yeasts(10×100)

如圖1所示，培養(yǎng)皿中有單菌落出現(xiàn)，菌落形態(tài)呈圓形，橢圓形，表面光滑濕潤，干燥，顏色呈乳白色、米黃色，表面有凸點，邊緣整齊。如圖2所示，顯微鏡下細胞染色為藍色，形態(tài)為橢圓、圓、卵圓、臘腸型等，無性繁殖方式為芽殖，一端出芽，細胞形態(tài)符合酵母菌特征。

2.2 酵母菌的生理生化鑒定結(jié)果

從18個樣品中分別分離出47株酵母菌，進行DGGE剔除重復(fù)菌株得到8株具有代表性的分離株，菌落形態(tài)和生理生化鑒定如表1和表2所示。

表1 菌株的形態(tài)Table 1 Morphology of the strains

結(jié)合表1酵母菌的菌落形態(tài)和表2生理生化試驗鑒定結(jié)果，根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9-12]可知，菌株W10被初步鑒定為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）；菌株S3被初步鑒定為發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentansc）；菌株S3被初步鑒定為東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。其他菌株多為多端出芽的生殖方式，菌落形態(tài)差異明顯，糖發(fā)酵試驗有明顯差異。另外，在碳源和氮源同化試驗中各菌株均表現(xiàn)出不同的生理特性。

表2 菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strains

2.3 酵母菌的26S rDNA鑒定

2.3.1 酵母菌的PCR擴增結(jié)果

將所提取菌株的總DNA用26S rDNA的區(qū)引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約500 bp左右的特異性擴增條帶，并且空白組無條帶出現(xiàn)，說明未出現(xiàn)污染、無非特異性擴增現(xiàn)象，結(jié)果見圖3。擴增產(chǎn)物大小符合目的片段要求，且條帶清晰，適合進行下一步DGGE試驗。

圖3 酵母菌PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products from yeasts

2.3.2 DGGE指紋圖譜剔除重復(fù)菌株

由于生理生化實驗和菌落狀態(tài)檢驗無法剔除重復(fù)菌株，因此進行DGGE試驗剔除重復(fù)菌株。提取酵母菌DNA，PCR-DGGE擴增引物，進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過DGGE剔除重復(fù)菌株。DGGE圖譜的條帶豐富度顯示了微生物菌落的多樣性，條帶越豐富，則多樣性越高[8]。菌株P(guān)CR-DGGE擴增圖譜如圖4，從DGGE圖譜上找到了不在同一水平線上的8個條帶，且條帶清晰，可知有不同的菌株8株。不同菌株其DNA不同，經(jīng)同一引物擴增后產(chǎn)物片段長度相似，但其核苷酸序列不同，因此不同雙鏈DNA片段沿著化學(xué)梯度的不同解鏈行為將在凝膠的不同位置上停止遷移，所以才可以用DGGE剔除重復(fù)菌株[12]。圖4中不同樣品間存在公共條帶，說明存在共有的酵母菌類型，而公共條帶亮度不同，表明酵母菌在DNA水平上有明顯差異。將不同條帶的菌株經(jīng)26S rDNA的區(qū)引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫比對。

圖4 菌株P(guān)CR-DGGE指紋圖譜Fig.4 PCR-DGGE fingerprint chromatogram of strains

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

47株酵母菌分離株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如表3所示。

表326S rDNA序列鑒定47株酵母菌結(jié)果Table 3 Identification results of 47 yeast strains by 26S rDNA sequences analysis

由表3可以看出，18份樣品中分離到47株酵母菌其中包括伊薩酵母（Issatchenkia）、酵母屬（Saccharomyces）、假絲酵母（Candida）、克魯維酵母（Kluyveromyces）、畢赤酵母（Pichia）、絲孢酵母（Trichosporon）6個屬，東方伊薩酵母（Issatchenkiaorientalis）、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、庫德畢赤酵母（Pichia kudri avzevii）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）、絲孢酵母（Trichosporon coremi iforme）8個種。其中庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）為優(yōu)勢菌株，占分離株的38.3%，其次為阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）。從18份樣品中分離到47株酵母菌通過PCR-DGGE指紋圖譜剔除重復(fù)菌株后，得到8株具有代表性的分離株（W10、S7、E9、S3、E1、D3、W2、S17）。8株典型的菌株經(jīng)PCR擴增，擴增產(chǎn)物送往上海生工測序，測序結(jié)果在NCBI使用BLAST比對初步確定菌株的屬，GenBank數(shù)據(jù)庫中將所得序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比較，用Mega5.0進行相似性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。

圖5 根據(jù)26S rDNA D1/D2區(qū)域序列生成的8株酵母菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 8 yeast strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences

由圖5可知，分離菌株W2與標(biāo)準菌株的同源性為94%，根據(jù)酵母菌種類劃分依據(jù)，同源相似率低于99%，不能劃為同一個種[13]，但結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，可判斷此菌株為阿薩希絲孢酵母菌（Trichosporon asahii）。其余所有分離菌株與之對應(yīng)的標(biāo)準菌株的同源性均在99%及以上，表明其具有較近的親緣性。菌株S7為馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）；菌株E9鑒定為單孢釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；W10鑒定為近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）；S17鑒定為絲孢酵母（Trichosporon coremiiforme）。

LOPANDICA K等[14]發(fā)現(xiàn)牛乳中漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii），白地霉（Geotrichum candidum），馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）和誕沫假絲酵母（Candidazeylanoides）是最主要的酵母菌屬；MUSHTAQ M[15]等研究表明，從酸奶和牛奶中分離出擲孢酵母（Bullera pyricola），假絲酵母（Candida succiphila），卡斯太拉德巴利酵母（Debaryomyces castellii），漢遜德巴利酵母（D.hansenii）和安格斯畢赤酵母（Pichia angusta）。王冠群等[16]對新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品及酵頭中酵母菌的分離鑒定，結(jié)果表明其中主要的酵母菌為單孢釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）。本試驗分離得到的優(yōu)勢菌為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和阿薩希絲孢酵母菌（Trichosporon asahii）。這說明傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中的酵母菌有其獨特的發(fā)酵菌種，可能與地緣差異、種類、氣候、制作方法等因素有關(guān)。

3 結(jié)論

本試驗對新疆塔城地區(qū)哈薩克族傳統(tǒng)酸奶18份樣品中酵母菌進行分離和鑒定，共得到47株酵母菌，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法、26S rDNA分子生物學(xué)鑒定。鑒定結(jié)果為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）18株，阿薩希絲孢酵母菌（Trichosporon asahii）10株，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）7株，絲孢酵母（Trichosporon coremiiforme）4株，馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）4株，東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）2株，發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）1株，近平滑假絲酵母（Candidaparapsilosis）1株。本試驗將傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)與PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于傳統(tǒng)乳制品中酵母菌的分離及優(yōu)勢菌群的篩選，并通過基因序列分析使菌種鑒定的準確性、可靠性提高。試驗中用PCR-DGGE方法從酸奶樣品中獲得的菌群結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)獲得的有一定的差異，只有將傳統(tǒng)分離方法與現(xiàn)代分子生物學(xué)方法相結(jié)合，才能更全面更真實地反映食品中微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性。本試驗用的乳制品樣品受環(huán)境因素等多方面的影響，樣品中優(yōu)勢菌群數(shù)量大大降低，給試驗中酵母菌的分離帶來了一定困難，導(dǎo)致從18份樣品中只分離到了47株酵母菌菌株。為進一步開發(fā)新疆現(xiàn)有的微生物資源，應(yīng)確保在無菌條件下采集具有新疆特色傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的新鮮樣品來進行酵母菌的分離篩選；對進一步認識并利用豐富的酵母菌資源具有重要意義；同時也為中國乳制品工業(yè)提供優(yōu)良酵母菌。

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Isolation,identification and phylogenetic analysis of yeast from traditional Xinjiang fermented yogurt

QIAO Chuanli,JIANG Caihong,JIN Dan,JIANG Aiting,LU Shiling,LI Wangqiang,LI Baokun*
(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

47 yeast strains were isolated from 18 samples of traditional home-made Xinjiang Kazakh naturally fermented yogurt,and then the strains were further identified by morphology analysis,physiological and biochemical identification,PCR-DGGE and 26S rDNA sequencing analysis,finally the phylogenetic tree was constructed.The results showed that the strains were identified as follows:18 strains ofPichia kudriavzevii,10 strains of Trichosporon asahii,7 strains ofSaccharomyces cerevisiae,4 strains ofTrichosporon coremiiforme,4 strains ofKluyveromyces marxianus,2 strains of Issatchenkia orientalis,1 strain ofPichia fermentans,1 strain ofCandida parapsilosis.Therefore,the identification results were significant to recognize and utilize the resource of yeast of traditional Kazakh fermented yogurt.

traditional fermented yogurt;26S rDNA D1/D2;screening;isolation and identification;PCR-DGGE

TS252.54

0254-5071（2017）04-0067-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.015

2016-11-15

國家自然基金地區(qū)項目（31460007）

喬傳麗（1992-），女，碩士研究生，研究方向為乳制品微生物。

*通訊作者：李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向為乳制品微生物。