竇少華，周新尚，遲乃玉，修志龍*

（1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；3.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

海洋低溫α-淀粉酶菌株Bacillus thuringiensisdsh 19-1發(fā)酵條件研究

竇少華1，2，3，周新尚2，3，遲乃玉2，3，修志龍1*

（1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024；2.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；3.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

α-淀粉酶是催化淀粉水解的酶類，其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。該研究利用響應(yīng)面法設(shè)計試驗，優(yōu)化了海洋低溫α-淀粉酶菌株Bacillus thuringiensisdsh 19-1的發(fā)酵條件。其最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間42.4 h，發(fā)酵溫度20.6℃，接種量4.1%。在上述優(yōu)化條件下α-淀粉酶酶活可達(dá)3.06 U/mL，較優(yōu)化前提高17.69%。

低溫α-淀粉酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；響應(yīng)面試驗

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）是一類重要的水解酶，它可將淀粉分子進(jìn)行內(nèi)部隨機(jī)切割α-1,4糖苷鍵，水解產(chǎn)物包括：糊精、麥芽寡糖、麥芽糖以及葡萄糖[1-2]。α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、紡織和醫(yī)藥等行業(yè)，世界淀粉酶產(chǎn)量約占整個酶制劑市場25%～33%[3-4]，其中大部分都是α-淀粉酶。目前，國內(nèi)外市場中常用的α-淀粉酶一般是中溫或高溫型，最適溫度高于50℃，在0～25℃范圍活力很低。并且維持其高溫作用體系需要的能耗較大，而低溫α-淀粉酶的最適作用溫度低于40℃[5]，與中高溫α-淀粉酶相比，其在食品、洗滌、制藥等多個領(lǐng)域有無法替代的優(yōu)越性。

本試驗是對大連黃海海泥中分離出一株低溫淀粉酶高產(chǎn)菌蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）dsh19-1的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，首先基于Plackett-Burman（P-B）試驗設(shè)計找出重要影響因子，然后經(jīng)Minitab15.0軟件中響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計對響應(yīng)過程變量進(jìn)行數(shù)學(xué)建模及分析，進(jìn)一步優(yōu)化響應(yīng)因子，確定最優(yōu)發(fā)酵條件，從而為該海洋低溫α-淀粉酶更深入研究及中試試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株（Bacillus thuringiensis）dsh19-1：分離自大連黃海海泥，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（編號—CCTCC AB 2015426）；蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、可溶性淀粉、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、瓊脂粉：生物工程（上海）股份有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱、DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計：龍尼柯儀器有限公司；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海審安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖1 g/L，K2HPO43 g/L，pH 7.0；1×105Pa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 14 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，pH7.0；1×105Pa滅菌30 min。

1.3.2 培養(yǎng)方法

將斜面保藏菌種活化，將處于對數(shù)期菌種按2%的接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為150 mL的500 mL三角瓶中，20℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.3 低溫淀粉酶粗酶液制備

發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。

1.3.4 酶活測定方法

酶活測定參照OKOLO B N等[6]方法。反應(yīng)體系如下：1%可溶性淀粉糊化液1.25 mL，0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH6.0）0.25 mL，去離子水0.25 mL，酶液0.25 mL。30℃反應(yīng)10 min?？瞻讓φ眨簩?.25 mL酶液替換為0.25 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（其余條件同上）。波長575 nm處測定吸光度值。酶活單位定義：在分析條件下，1 min釋放1 μmol的還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位，酶活力單位為U/mL。還原糖含量以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法進(jìn)行測定[7]。

1.3.5 發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以低溫α-淀粉酶酶活為響應(yīng)值，選取對其影響顯著的因素以及因素較好的水平區(qū)間，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面分析法對發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件組成。每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

表1Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝是目前優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)最常用的方法，而且在很多試驗中取得了顯著的效果[8-10]。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用N=8的Plackett-Burman設(shè)計對低溫α-淀粉酶發(fā)酵條件中的5個因素對低溫α-淀粉酶生產(chǎn)的顯著性進(jìn)行考察，試驗設(shè)計及結(jié)果分結(jié)果見表1、表2。利用Minitab15.0軟件進(jìn)行分析，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量為3個影響較為顯著的因素。

表2Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是為了確定顯著影響因素的取值逼近中心點以及提高低溫α-淀粉酶的產(chǎn)量，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量這3個因素的變化方向和步長的試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。由表3可知，3個顯著影響因素的中心點在第2組試驗附近，因此確定以第2組的水平作為響應(yīng)面試驗的中心點，即發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量分別為42 h，20℃和4%。

表3 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of steepest ascent experiments

2.3 響應(yīng)面設(shè)計分析結(jié)果

通過Plackett-Burman試驗設(shè)計，采用Box-Behnken法，以低溫α-淀粉酶酶活（Y）為響應(yīng)值，試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表4和表5，利用Minitab15.0軟件對結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析。得到回歸方程為：

式中：Y為低溫α-淀粉酶活力，U/g；X1為發(fā)酵時間，h；X2為發(fā)

酵溫度，℃；X3為接種量，%

回歸方程的方差分析結(jié)果見表6。由表6可知，顯著水平為0.05時，X1，X1X1，X2X2，X3X3是顯著的。由表6可知，回歸方程顯著性（P值）為0.001，為非常顯著，模型失擬項：0.178＞0.05，模型失擬項不顯著，說明模型選擇比較合適?；貧w系數(shù)R2=0.978 3＞0.9，說明模型相關(guān)度很好。因此，可以使用該模型來分析響應(yīng)值的變化。

表4 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of response surface experiments for strain fermentation conditions optimization

表5 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken設(shè)計結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of Box-Behnken design for strain fermentation conditions optimization

表6 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of response surface experiments results

2.4 響應(yīng)面最優(yōu)結(jié)果分析

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量間的交換作用以及確定最優(yōu)點，通過Minitab軟件繪制響應(yīng)面曲線圖進(jìn)行可視化分析，3組以低溫α-淀粉酶酶活為響應(yīng)值的趨勢圖見圖1。其等高線圖可直觀反應(yīng)出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。圖1A等高線接近圓形，交互作用不顯著；圖1A、圖1B等高線均呈橢圓形，表明兩個因素交互作用均顯著，并且由圖可知，發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間與接種量的交互作用最強(qiáng)。

圖1 發(fā)酵時間、接種量與發(fā)酵溫度交互作用對酶活的響應(yīng)曲面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,inoculum and temperature on enzyme activity

由圖1可知，響應(yīng)值存在最大值，經(jīng)軟件分析獲得酶活預(yù)測值最大時對應(yīng)的發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間42.4 h，發(fā)酵溫度20.6℃，接種量4.1%，在此條件下預(yù)測最大酶活為3.07 U/mL，實測3次平均酶活為3.06 U/mL，與理論值基本一致，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳條件準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法對低溫α-淀粉酶菌株Bacillusthuringiensis dsh19-1發(fā)酵條件進(jìn)行研究，得到最優(yōu)發(fā)酵條件：發(fā)酵時間42.4 h，發(fā)酵溫度20.6℃，接種量4.1%。此發(fā)酵條件下，低溫α-淀粉酶酶活達(dá)到3.06 U/mL，比優(yōu)化之前提高了17.69%。

Bacillus thuringiensisdsh19-1最適生長溫度為20℃，根據(jù)MORITA RY[11]對低溫微生物的定義，該菌株屬于耐冷菌，發(fā)酵粗酶液最適作用溫度為20℃，屬于低溫酶。近年來，隨著對極端酶的不斷研究，來源于海洋及極地的淀粉酶菌株陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[12-15]，但據(jù)文獻(xiàn)查閱情況看，目前尚未有蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）產(chǎn)海洋低溫α-淀粉酶的報道。因此，對該菌株發(fā)酵條件的研究，可為其進(jìn)一步發(fā)酵放大乃至工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

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Fermentation conditions of marine low-temperature α-amylase-producingBacillus thuringiensisdsh 19-1

DOU Shaohua1,2,3,ZHOU Xinshang2,3,CHI Naiyu2,3,XIU Zhilong1*
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China; 2.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 3.Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China)

α-amylase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of starch,which is widely used in food,medicine and other fields.The fermentation conditions of marine low temperature α-amylase-producingBacillus thuringiensisdsh 19-1 were optimized with response surface methodology.The optimum fermentation conditions were fermentation time 42.4 h,temperature 20.6℃,inoculum 4.1%.Under the conditions,the α-amylase activity was up to 3.06 U/ml,which was 17.69%higher than that of before the optimization.

low-temperature α-amylase;fermentation conditions optimization;response surface experiments

TS23

0254-5071（2017）04-0036-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.008

2017-01-05

遼寧省自然科學(xué)基金項目（No.2014020134）

竇少華（1979-），男，副教授，博士研究生，研究方向為微生物工程及酶工程。

*通訊作者：修志龍（1965-），男，教授，博士，研究方向為生物轉(zhuǎn)化與分離。