申佩娟，苗利華，李娜，劉曉霞，馮欣，2，孟慶恒，2*，孫建華，2

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

海洋枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲卵及二齡幼蟲的影響

申佩娟1，苗利華1，李娜1，劉曉霞1，馮欣1，2，孟慶恒1，2*，孫建華1，2

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

實(shí)驗(yàn)以根結(jié)線蟲的卵、卵囊和二齡幼蟲（J2）為研究對(duì)象，對(duì)海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531發(fā)酵液處理根結(jié)線蟲不同發(fā)育階段的殺線作用進(jìn)行了效果評(píng)價(jià)，并以J2幼蟲為靶標(biāo)，與市面上的滅線磷及阿維菌素的藥效進(jìn)行了初步對(duì)比。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)條件下，海洋枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲卵囊和分散卵的孵化以及J2幼蟲的活力均具有明顯抑制作用，其對(duì)卵囊孵化的抑制作用達(dá)40.18%；對(duì)分散卵孵化的抑制作用可達(dá)84.28%；而對(duì)J2幼蟲的殺線作用最為顯著，校正死亡率高達(dá)97.41%，高于實(shí)驗(yàn)條件下滅線磷及阿維菌素的測(cè)定值，在根結(jié)線蟲的生物防控方面顯現(xiàn)出潛在的研究?jī)r(jià)值。

海洋枝頂孢霉BH0531；根結(jié)線蟲；卵孵化；二齡幼蟲；抑制作用

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是植物寄生線蟲中種類最多、分布最廣且危害最嚴(yán)重的一類線蟲[1]。其中南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、花生根結(jié)線蟲（Meloidogyne arenaria）、爪哇根結(jié)線蟲（Meloidugyne javanica）和北方根結(jié)線蟲（Meloidogyne hapla）4種線蟲的危害最為嚴(yán)重，占根結(jié)線蟲危害的90%以上[2-3]，涉及114科3 000多種寄主植物[4]，其防治任重而道遠(yuǎn)。

目前，根結(jié)線蟲的防治仍以化學(xué)防治為主要手段，但是其在環(huán)境友好和可持續(xù)發(fā)展方面存在明顯的缺陷。因此，根結(jié)線蟲的生物防治受到了越來越多的關(guān)注，且有淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）和阿維菌素[5]已應(yīng)用于實(shí)踐。理想的生防制劑應(yīng)具備殺線效果好，水溶好、耐熱、pH范圍相對(duì)寬泛以適應(yīng)不同土壤環(huán)境，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)。以松材線蟲（Bursaphelenchusxylophilus）為靶標(biāo)篩選出來的海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531代謝物不僅具有明確的殺線作用，還具有分子質(zhì)量小、水溶性好且耐熱，與大多數(shù)土壤環(huán)境相符的pH適應(yīng)范圍的特點(diǎn)[6]。進(jìn)一步的黃瓜盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌所產(chǎn)生的活性代謝物對(duì)南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）同樣有明確的殺線活性，并使根結(jié)指數(shù)明顯降低，同時(shí)還具有改善土壤微生態(tài)環(huán)境的作用[7]；相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液對(duì)染病植株的生長(zhǎng)及保護(hù)酶具有促進(jìn)作用[8-9]，而對(duì)線蟲體內(nèi)保護(hù)酶則呈現(xiàn)出抑制作用[10]。為進(jìn)一步探究其對(duì)線蟲發(fā)揮作用的具體階段，本研究以根結(jié)線蟲的卵、卵囊和二齡幼蟲（J2）為研究對(duì)象，采用室內(nèi)浸漬方法，對(duì)該菌發(fā)酵液在線蟲不同發(fā)育階段的殺線作用進(jìn)行了效果評(píng)價(jià)，并以J2幼蟲為靶標(biāo)，與滅線磷和阿維菌素的效果進(jìn)行了初步比較，旨在為進(jìn)一步揭示其作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種及線蟲

海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531，菌種保藏號(hào)CGMCC-5445，由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、蟲卵、卵囊和二齡幼蟲（J2）：采自天津市寶坻區(qū)城關(guān)鎮(zhèn)圣人莊黃瓜蔬菜大棚。

1.1.2 化學(xué)試劑

阿維菌素（abamectin）乳油：河北省伊諾化工有限公司；滅線磷（ethoprophos）乳油：北京中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)所研制；葡萄糖、蔗糖、次氯酸鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；瓊脂：天津市化學(xué)試劑廠三廠；無水乙醇（分析純）：天津市化學(xué)試劑廠二廠。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮土豆（浸汁）200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮土豆（浸汁）200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZ5-2雷勃爾離心機(jī)：北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、G2X-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZ-2010K控溫?fù)u瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；YXQG02型電熱式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械廠；XTL500解剖鏡、XTB-A5538體式顯微鏡：桂林光學(xué)儀器廠；USOS-503型中空纖維素膜組件：天津膜天膜工程技術(shù)有限公司；線蟲標(biāo)準(zhǔn)篩：浙江上虞市公路儀器廠；48孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：美國(guó)康寧公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

菌種活化：將保藏的海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.）菌種接入斜面培養(yǎng)基，26℃靜置培養(yǎng)6～7 d。

孢子懸浮液的制備：取新培養(yǎng)的菌株斜面，加入無菌水洗下孢子，制備成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液。

發(fā)酵液的制備：以2%接種量將孢子懸浮液接入裝液量為50 mL/250mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。26℃、120 r/min培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)好的菌液10 000 r/min離心除去菌體，經(jīng)孔徑為0.22 μm微孔濾膜真空抽濾除菌，再經(jīng)截留分子質(zhì)量為6 000 u的中空纖維素膜組件過濾，收集小分子濾液即為小分子發(fā)酵濾，60℃真空蒸干濃縮，備用。

1.3.2 根結(jié)線蟲的獲取

根結(jié)線蟲卵囊的制備：參見BIESMEIJER J C等[11]的方法，取病根于解剖鏡下挑取大小較為一致的卵囊，用0.5%的次氯酸鈉表面消毒3～5 min，再用無菌水漂洗3～4次，去除殘留的次氯酸鈉，備用。

根結(jié)線蟲分散卵制備：采用改良的振蕩法分離線蟲。將病根剪成1～2 cm的小段，加入1%體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉溶液，用粉碎機(jī)粉碎。分別過100目、300目和500目分樣篩，收集500目分樣篩截留物，即為根結(jié)線蟲卵粗提物。蟲卵粗提物懸于40%的蔗糖溶液上層，3 500 r/min、5 min條件下離心，交界面的白色懸浮物即蟲卵，用移液器吸出，洗掉糖液，配制成1 000個(gè)/mL，備用[8]。

根結(jié)線蟲J2幼蟲的制備：將蟲卵放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待蟲卵孵化，采用貝爾曼漏斗法收集2齡幼蟲，配制成1 000條/mL，備用[8]。

1.3.3 根結(jié)線蟲卵囊卵孵化率的測(cè)定

借鑒GIANNAKOU I O等[12]的浸漬法測(cè)定：取濃度為濃縮16倍、濃縮4倍、原液、稀釋4倍、稀釋16倍的發(fā)酵液各500 μL分別注入48孔板各孔，各置入一個(gè)卵囊，以無菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于21℃條件下培養(yǎng)6 d，每天稍微振蕩一下保證通氣。剖開卵囊計(jì)未孵化數(shù)，計(jì)算卵總數(shù)（顯微鏡下計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)），各個(gè)處理組的孵化率及其對(duì)應(yīng)的相對(duì)抑制率計(jì)算公式如下：

1.3.4 根結(jié)線蟲分散卵孵化率的測(cè)定

取濃度分別為濃縮16倍、濃縮4倍、原液、稀釋4倍、稀釋16倍的發(fā)酵液各100 μL分別注入96孔各孔，各置入100 μL處理好的分散卵懸浮液，以無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。于21℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，每天稍微振蕩一下保證通氣。在顯微鏡下計(jì)數(shù)并處理數(shù)據(jù)得到各處理的孵化率及其對(duì)應(yīng)的相對(duì)孵化抑制率。

1.3.5 不同殺線劑對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲的殺線率的測(cè)定

按表1設(shè)置濃度[13-14]分別向96孔板各孔加入100 μL藥液，再加入等體積的根結(jié)二齡線蟲（J2）懸浮液100 μL，以無菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)（見表1）。于26℃條件下培養(yǎng)5 d，于顯微鏡下計(jì)數(shù)，死亡率、校正死亡率計(jì)算公式如下[15]：

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理Table 1 Design and treatment of the experiments

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS Statistics 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異性顯著分析和采用概率單位法（PROBIT模型）計(jì)算出供試藥液的回歸方程及半數(shù)致死量（50%lethal dose，LD50）值、95%的置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲卵囊卵孵化的抑制作用

由圖1可知，枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲卵囊的卵的孵化有較為明顯的抑制效果，4倍濃縮液條件下卵的孵化率為34.66%，較對(duì)照降低了20.96%。除16倍稀釋液外，其余各濃度發(fā)酵液與對(duì)照相比均存在顯著差異（P＜0.05），孵化率均明顯低于對(duì)照組。顯示出該發(fā)酵液對(duì)卵囊中卵的孵化具有明確的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制效果與發(fā)酵液濃度成正相關(guān)效應(yīng)。值得注意的是，過高的濃度對(duì)卵囊的外膜物質(zhì)可能會(huì)產(chǎn)生鈍化作用。

圖1 枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲卵囊的孵化率的影響Fig.1 Effect ofAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth on hatching rate of egg masses from root-knot nematodes

2.2 發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲分散卵孵化的抑制作用

由圖2可知，枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531發(fā)酵液對(duì)分散卵孵化具有明顯的抑制作用，高濃度（16倍濃縮液）條件下卵的孵化率僅為8.31%，較對(duì)照降低了66.46%。除16倍稀釋液外，其余各濃度發(fā)酵液與對(duì)照相比均存在顯著差異（P＜0.05），且孵化率均明顯低于清水組。結(jié)果表明，該發(fā)酵液對(duì)分散卵的孵化具有明確的抑制作用，且其抑制效果與發(fā)酵液濃度呈正相關(guān)效應(yīng)。此外，高濃度發(fā)酵液對(duì)分散卵的相對(duì)孵化抑制作用明顯高于對(duì)卵囊的相對(duì)孵化抑制作用。

圖2 枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲分散卵孵化率的影響Fig.2 Effect ofAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth on hatching rate of individual eggs from root-knot nematodes

2.3 發(fā)酵液與滅線磷和阿維菌素對(duì)根結(jié)線蟲J2的殺線效果比較

枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531發(fā)酵液與滅線磷和阿維菌素對(duì)根結(jié)線蟲J2的殺線效果比較結(jié)果見表2。

表2 枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲作用影響Table 2 Effect ofAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth on J2 of root-knot nematodes

由表2可知，不同濃度的枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液、滅線磷和阿維菌素對(duì)根結(jié)線蟲J2的活性均有較高的抑制作用，校正死亡率均高于70%。每種藥液的各個(gè)濃度之間對(duì)根結(jié)線蟲J2活性的影響差異顯著（P＜0.05），同樣表現(xiàn)出濃度相關(guān)性。在設(shè)定的實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，最高殺線率出現(xiàn)在BH0531發(fā)酵液的4倍濃縮液組，校正死亡率高達(dá)97.81%。而實(shí)驗(yàn)條件下40%滅線磷和1.8%阿維菌素EC的最高殺線率均未＞90%，且三種藥液實(shí)驗(yàn)條件下的最高校正死亡率組間表現(xiàn)出極顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)果表明，枝頂孢霉BH0531發(fā)酵液的在根結(jié)線蟲防治上應(yīng)用的潛在優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究以松材線蟲為靶標(biāo)線蟲，所篩選出的海洋真菌枝頂孢霉（Acremoniumsp.）BH0531其發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲同樣具有明確的殺線作用，該發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲二齡幼蟲J2的作用最為顯著，可高達(dá)97.81%，達(dá)到A級(jí)水平（≥90%）；其次表現(xiàn)為對(duì)分散卵的孵化抑制作用，抑制率高達(dá)84.28%，而對(duì)卵囊中卵的抑制作用也達(dá)40.18%。發(fā)酵液的作用效果與活性物質(zhì)的濃度和線蟲的裸露程度，以及生理活力程度有關(guān)，呈現(xiàn)出濃度越高，殺線率/孵化抑制率越高的一般規(guī)律。另一方面，相對(duì)于J2幼蟲，分散卵和卵囊的裸露程度及生理活力程度遞減，其作用效果也隨之降低。這可能與卵外的膠質(zhì)層相關(guān)，膠質(zhì)層能有效的保護(hù)卵囊中的卵粒[16]。與市面上的殺線劑滅線磷和阿維菌素進(jìn)行對(duì)比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管最高殺線活性（97.81%）是在發(fā)酵液處理組，但從LD50的測(cè)定值來看，發(fā)酵液在實(shí)驗(yàn)條件下的用量遠(yuǎn)大于2種市售殺線劑，表明發(fā)酵液有效活性物質(zhì)凈含量還比較低，因此，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高活性物質(zhì)產(chǎn)量，并對(duì)有效活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化和鑒定已成為今后開發(fā)及充分利用的關(guān)鍵。

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Effect of fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on egg and 2ndstage juveniles of root-knot nematodes

SHEN Peijuan1,MIAO Lihua1,LI Na1,LIU Xiaoxia1,FENG Xin1,2,MENG Qingheng1,2*,SUN Jianhua1,2
(1.College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin 300387,China)

Using the eggs,egg masses and 2ndstage juveniles(J2)of root-knot nematodes as research object,the nematicidal effect of fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on root-knot nematodes of different development stages was evaluated.With the J2 as target,the pesticide effect of fermentation broth was compared with ethoprophos and abamectin sold on the market.The results showed that under the experimental conditions,the fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 all had obvious inhibitory effect on the vitality of egg masses, individual eggs hatching and J2,and the inhibiting effect of fermentation broth on egg masses,individual eggs hatching were 40.18%and 84.28%, respectively.The nematicidal effect on J2 was the most significant,the corrected death rate was up to 97.41%,which was higher than that of ethoprophos and abamectin under the experimental conditions.These results suggested that the fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp. BH0531 had its potential value in the bio-control of root-knot nematode.

marine-derivedAcremoniumsp.BH0531;root-knot nematodes;egg hatching;2ndstage juveniles;inhibiting effect

Q939.9；S432.4

0254-5071（2017）04-0026-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.006

2017-01-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31272019）；天津市自然基金聯(lián)合項(xiàng)目（15JCYBJC51400）

申佩娟（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锏幕钚晕镔|(zhì)。

*通訊作者：孟慶恒（1963-），副教授，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。