李博萍, 劉秀麗, 邱 倩

(隴東學院, 1. 岐伯醫(yī)學院; 2. 生命科學與技術學院, 甘肅 慶陽, 745000)

?

論 著

葛根素對老年大鼠抗氧化作用的研究

李博萍1, 劉秀麗2, 邱 倩1

(隴東學院, 1. 岐伯醫(yī)學院; 2. 生命科學與技術學院, 甘肅 慶陽, 745000)

目的 研究葛根素對老年大鼠的抗氧化作用。方法 取10只2月齡大鼠為對照組，取30只12月齡SD老年大鼠，分為陰性對照組，陽性對照組和葛根素組，服藥組每日灌服25 mg/kg脫水淫羊藿素，陽性對照組每日灌服15 mg/kg U-74006F, 青年大鼠和老年大鼠對照組灌服給予等體積蒸餾水。2個月后麻醉處死大鼠。取血清檢測氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，同時檢測血清中總抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)和 谷胱甘肽(GSH-Px)的活性。剝離大鼠肝臟和腦組織，研磨提取總蛋白后檢測MAD含量，檢測組織中T-AOC、SOD和GSH-Px活性。研磨腦組織后提取總RNA后, RT-PCR檢測SOD和過氧化氫酶(CAT)基因表達量。結(jié)果 與青年大鼠相比，老年大鼠血清、肝臟和腦組織中MDA含量顯著升高。同時血清和組織中抗氧化因子T-AOC、SOD和GSH-Px活性顯著下降。老年大鼠服藥后，與陰性對照組相比，葛根素和U-74006F均能顯著降低老年大鼠血清和肝臟組織中MDA含量，但以陽性藥物U-74006F效果最為明顯，與葛根素組相比具有統(tǒng)計學意義。此外，與陰性對照組相比，葛根素和U-74006F均能顯著提高血清和肝臟組織中T-AOC、SOD和GSH-Px的活性。陽性藥物U-74006F能夠顯著降低腦組織中MAD的含量，同時提高抗氧化因子T-AOC、SOD和GSH-Px活性，然而葛根素對于腦組織中MAD的含量和SOD、GSH-Px活性無顯著影響，但能夠顯著提高總抗氧化能力T-AOC的活性。此外, RT-PCR檢測結(jié)果顯示，葛根素和U-74006F均能顯著肝臟組織中SOD和CAT基因表達量。結(jié)論 葛根素能夠顯著提高老年大鼠體內(nèi)抗氧化因子的活性，降低氧化產(chǎn)物的含量，對于老年大鼠具有很好的抗氧化作用。

老年大鼠; 抗氧化; 葛根素; SOD

葛根素是豆科植物葛根的主要成分，其具有提高免疫力，增強心肌收縮力，保護心肌細胞，降低血液，抗血小板凝集等作用[1-3]。研究[4-6]表明，葛根的主要提取物葛根黃酮和葛根素具有較強的抗氧化能力，其對于DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基都很強的抑制能力。本文探討葛根素對老年大鼠是否具有抗氧化能力，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

葛根素對照品購自寶雞市辰光生物科技有限公司，分子式為C12H20O9, 批號為20140711, 純度為99.04%。將葛根素用蒸餾水配制成2.5 mg/mL的懸浮液，按照大鼠體質(zhì)量每100 g灌服2.5 mg藥物進行灌胃處理。

1.2 動物

2月齡SD雌性大鼠10只, 12月齡SD雌性大鼠30只，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(甘)2016-0001。

1.3 試劑

丙二醛(MDA)測定試劑盒，購自南京建成，批號: 20160325; 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定試劑盒，購自南京建成，批號: 20161021; T-AOC測定試劑盒，購自南京建成，批號: 20160915; 谷光甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性測定試劑盒，購自南京建成，批號: 20160925。RNAiso Reagent購自TaKaRa公司，批號: AA4602-1; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，批號: AK5302; Taq DNA聚合酶和Easy D ilution稀釋液均購自TaKaRa公司，批號: AK7703。引物由TaKaRa公司設計并合成。U-74006F購自Sigma公司，批號: 071M4821V。

1.4 儀器

酶標儀(美國Bio-Rad), 紫外分光光度計(德國Heraeus), 臺式高速冷凍離心機(德國Heraeus), 實時熒光定量PCR儀(美國ABI)。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗分組與處理: 10只2月齡大鼠為對照組, 10只12月齡大鼠為陰性對照組, 10只12月齡大鼠服用U-74006F為陽性對照組, 10只12月齡大鼠為葛根素組，葛根素用蒸餾水配成2.5 mg/mL的懸浮液，按每只大鼠25 mg/kg體質(zhì)量給藥。U-74006F用蒸餾水配成1.5 mg/mL的懸浮液，按每只大鼠15 mg/kg體質(zhì)量給藥。服藥組每日灌服U-74006F或葛根素，對照組給予等體積蒸餾水。灌藥60 d后麻醉處死大鼠，心臟取血后4 000 r/min離心10 min, 提取血清。同時剝離肝臟、腦組織后, -80 ℃保存。

1.5.2 血清中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px測定：藥物處理大鼠60 d后, 10%水合三氯乙醛麻醉處死大鼠，腹腔靜脈缺血后, 4 000 r/min離心10 min, 提取血清，根據(jù)試劑盒說明書操作測定各項指標。

1.5.3 肝臟和腦組織中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px測定：大鼠灌藥60 d后, 10%水合三氯乙醛麻醉處死，剝離肝臟和腦組織，取1 g組織并無菌PBS清洗3次，剪碎組織后加液氮研磨，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液300 μL, 冰浴裂解5 min, 12 000 r/min離心15 min，取上清提取總蛋白后，進行蛋白定量，根據(jù)試劑盒說明書操作測定各項指標。

1.5.4 RT-PCR檢測：大鼠灌藥60 d后, 10%水合三氯乙醛麻醉處死，剝離腦組織，無菌PBS清洗3次后，加液氮研磨后，加入Trizol后提取總RNA, 紫外分光光度計檢測RNA的濃度及純度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，取2 μL進行RT-PCR檢測，逆轉(zhuǎn)錄過程及RT-PCR過程參照說明書進行。最終結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果利用2-ΔΔCt表示。引物信息見表1。

表1 Real Time PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，各組間是否存在差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)分析，兩組間的差異比較用 LSD 檢驗法(方差齊)來判斷是否有顯著性差異,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 葛根素對血清中MDA、SOD、T-AOC和

GSH-Px的影響

血清中MAD檢測結(jié)果顯示，老年大鼠MAD含量顯著高于青年大鼠(P<0.01), 當老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，血清中MAD含量顯著降低，與老年大鼠組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。血清中總抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性檢測結(jié)果顯示，與青年大鼠相比，老年大鼠T-AOC、SOD和GSH-Px的活性顯著降低，當服用U-74006F和葛根素后，老年大鼠T-AOC、SOD和GSH-Px的活性均有不同程度的升高，與老年大鼠相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。說明葛根素具有降低老年大鼠血清中氧化因子的含量，提高抗氧化因子活性的能力。見表2。

表2 葛根素對血清中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px的影響(n=10)

與青年大鼠組比較, **P<0.01; 與老年大鼠組比較, △P<0.05, △△P<0.01。

2.2 葛根素對肝臟組織中MDA、T-AOC、SOD和

GSH-Px的影響

與青年大鼠相比，老年大鼠肝臟中MAD的含量顯著增加(P<0.01), 同時總抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性均顯著低于青年大鼠(P<0.01)。老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，與老年大鼠相比，服藥組MAD的含量顯著降低(P<0.01)。同時，服藥組總抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性顯著高于老年大鼠組(P<0.01), 但與青年大鼠組相比，服藥的老年大鼠SOD和GSH-Px活性仍相對降低(P<0.01)。說明葛根素能夠降低老年大鼠肝臟中氧化因子的含量，具有提高老年大鼠抗氧化因子活性的能力。見表3。

表3 葛根素對肝臟組織中MDA、T-AOC、SOD和GSH-Px的影響(n=10)

與青年大鼠組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與老年大鼠組比較, △△P<0.01。

2.3 葛根素對腦組織中MDA、T-AOC、SOD和

GSH-Px的影響

腦組織中MDA檢測結(jié)果顯示，老年大鼠MAD含量顯著高于青年大鼠(P<0.01), 當老年大鼠服用U-74006F, 血清中MAD含量顯著降低(P<0.01), 然而服用葛根素的大鼠MAD含量略高于老年大鼠組，與后者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與青年大鼠相比，老年大鼠總抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性顯著低于青年大鼠組(P<0.01), 當老年大鼠服用U-74006F后，總抗氧化能力T-AOC和抗氧化因子SOD、GSH-Px活性顯著高于老年大鼠組(P<0.01)。而服用葛根素的大鼠，其抗氧化因子SOD和GSH-Px活性與老年大鼠組相比無顯著差異(P>0.05), 而葛根素組大鼠總抗氧化能力T-AOC顯著高于老年大鼠(P<0.01)。說明葛根素對老年大鼠腦組織中的氧化物含量及抗氧化因子活性物顯著影響，但能夠提高總抗氧化能力。見表4。

2.4 葛根素對大鼠腦組織SOD和CAT基因表達

的影響

與青年大鼠相比，老年大鼠SOD和CAT的基因表達量顯著下降(P<0.01)。當老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，老年大鼠SOD和CAT的基因表達量有顯著上升，與老年大鼠相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01), 但與青年大鼠相比仍顯著較低(P<0.01)。見表5。

表4 葛根素對腦組織中MAD、T-AOC、SOD和GSH-Px的影響(n=10)

與青年大鼠組比較, **P<0.01; 與老年大鼠組比較, △△P<0.01。

表5 葛根素素對腦組織中 SOD和CAT基因表達量的影響(n=10)

與青年大鼠組比較, **P<0.01;

與老年大鼠組比較, △P<0.05, △△P<0.01。

2.5 葛根素對腦組織中SOD和CAT蛋白表達的影響

與青年大鼠相比，老年大鼠SOD和CAT的蛋白表達量顯著下降。當老年大鼠服用U-74006F和葛根素后，老年大鼠SOD和CAT的蛋白表達量有明顯上升，且病理切片顯示, SOD和CAT在腦組織中具有共定位現(xiàn)象。見圖1。

圖1 SOD和CAT免疫組織熒光染色結(jié)果

3 討 論

葛根素是豆科植物葛根的主要成分，其具有抗心律失常、抗心肌缺血、提高免疫力等功效。研究表明，葛根素具有很好的抗氧化活性。研究[7]表明，葛根素能夠顯著提高HaCaT細胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)的活性，統(tǒng)計能夠降低細胞內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MAD)的含量。研究[8]表明，葛根素能夠降低過氧化氫誘導的人血管內(nèi)皮細胞MAD含量增加的現(xiàn)象，葛根素對過氧化氫誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。

本研究表明，葛根素能顯著降低血清和肝臟組織中的MAD的含量，同時提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPH-Px)和總抗氧化能力(T-AOC)的活性，此外，葛根素能夠顯著提高肝臟中SOD和過氧化氫酶(CAT) mRNA的表達量。然而，葛根素對于腦組織中MAD含量及SOD和GPH-Pχ活性影響不大。因而作者推測，葛根素對于老年大鼠肝臟和血清具有很好的抗氧化活性。體外研究[9]表明，葛根素在多種細胞中具有抗氧化活性，葛根素能夠保護氧化應激導致的BMSCs損傷，提高細胞增殖能力，增強細胞堿性磷酸酶活性，降低細胞內(nèi)活性氧含量，抑制細胞凋亡，葛根素通過抗氧化作用，抑制細胞凋亡，發(fā)揮對BMSCs氧化損傷的保護。研究[10]表明，葛根素能夠提高肺組織細胞SOD的活性，降低一氧化氮和MAD的含量。研究[11]表明，葛根素抑制過氧化氫誘導大鼠晶體上皮細胞凋亡，對該細胞具有很好的抗氧化保護作用。因此，葛根素對老年大鼠其它組織是否具有抗氧化活性仍待研究。

綜上所述，本文表明葛根素能夠顯著降低老年大鼠血清和肝臟組織中氧化因子的含量，提高其抗氧化因子的活性。葛根素對肝臟組織具有很好的抗氧化活性，但其對腦組織的抗氧化作用不明顯。

[1] 瑙珉, 江培. 葛根素藥理作用研究進展[J]. 黑龍江科技信息, 2014; 1(32): 85-85.

[2] 容林, 楊旭東, 陳理軍, 等. 葛根素藥理作用及其作用機制研究新進展[J]. 大眾科技, 2014; 1(6): 138-142.

[3] 汪群紅, 章靈芝, 徐文偉, 等. 葛根素的藥理作用與不良反應分析[J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2015; 1(5): 1185-1187.

[4] 龔志剛, 胡紅霞, 朱篤, 等. 葛根素對糖尿病大鼠血糖和抗氧化能力的影響[J]. 食品科學, 2006; 27(11): 498-501.

[5] 張遠榮, 蔣企洲. 葛根素的抗氧化活性作用[J]. 實用臨床醫(yī)藥雜志, 2005; 9(5): 92-93.

[6] 朱慶磊, 何愛霞, 呂欣然. 葛根素對氧自由基的清除和抗氧化性損傷作用[J]. 解放軍藥學學報, 2001; 17(1): 1-3.

[7] 黃綿慶, 楊照新, 姚茂忠, 等. 葛根素對中波紫外線損傷HaCaT細胞的抗氧化作用[J]. 重慶醫(yī)學, 2012; 41(19): 1915-1916.

[8] 高培國, 強輝, 凌鳴. 葛根素對過氧化氫誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用[J]. 西安交通大學學報: 醫(yī)學版, 2012; 33(2): 121-124.

[9] 高培國, 強輝. 葛根素對骨髓基質(zhì)干細胞氧化損傷的保護作用[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志: 電子版, 2011; 05(4): 157-159.

[10] 郝卯林, 徐正衸, 王方巖, 等. 葛根素對兔肺缺血再灌注損傷中細胞凋亡的影響[J]. 溫州醫(yī)科大學學報, 2005; 35(2): 92-95.

[11] 岳輝, 熊煒. 葛根素抑制過氧化氫誘導大鼠晶體上皮細胞凋亡的研究[J]. 醫(yī)學臨床研究, 2003; 20(12): 895-897.

Antioxidant activities of puerarin on aged rats

LI Boping1, LIU Xiuli2, QIU Qian1

(1.QiboMedicalSchool; 2.SchoolofLifeScienceandTechnology,LongdongUniversity,Qingyang,Gansu, 745000)

Objective To explore the antioxidant activities of puerarin on aged rats. Methods Ten 2-month-old SD rats were selected as control group. Thirty 12-month-old SD rats were divided into negative control group, positive control group and puerarin group. Rats in medication were given an oral administration of 25 mg/kg puerarin and 15 mg/kg U-74006F, while other rats were given an administration of same volume of distilled water. Two months later, all the rats were sacrificed and blood was collected, and serum level of malondialdehyde (MDA) and activities of total antioxidant activity (T-AOC), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH-Px) were measured. The levels of MAD and activities of T-AOC, SOD and GSH-Px in liver and brain were also detected. Besides, the mRNA expressions of SOD and CAT in liver were analyzed in all the groups. Results The serum level of MDA and the activities of T-AOC, SOD and GSH-Px in aged rat group were significantly lower than young rat group. After the treatment of puerarin and U-74006F, the serum and liver levels of MDA decreased and the activities of SOD, T-AOC and GSH-Px increased significantly, and were significantly higher than aged rat group. The level of MDA decreased and the activities of SOD, T-AOC and GSH-Px increased significantly in brain after the treatment of U-74006F. Puerarin had no effects on MAD, SOD and GSH-Px except increased the activity of T-AOC. The mRNA expression of SOD and CAT of aged rat were significantly lower than young rat group, and after puerarin treatment this phenomenon was weakened. Conclusion Puerarin can increase the activities of antioxidant factors and had notable antioxidant functions on aged rats.

puerarin; antioxidant; aged rat; SOD

2017-02-05

甘肅省科技計劃項目(1606RJYM226)

R 284

A

1672-2353(2017)07-001-04

10.7619/jcmp.201707001