鄧家征，申 洋，凌 晶，鄧 宏，樂永紅，莊小芳

·非酒精性脂肪性肝病·

轉(zhuǎn)化生長因子α-435G/A基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病相互關(guān)系研究

鄧家征，申 洋，凌 晶，鄧 宏，樂永紅，莊小芳

目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）α-435G/A基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）發(fā)病之間的相互關(guān)系。方法選取我院2013年2月至2015年2月收治的NAFLD患者126例作為研究對象，同時以121例正常人作為對照組，采用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析法對上述研究對象外周血TGFα-435G/A基因進(jìn)行多態(tài)性分析，所獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析。結(jié)果NAFLD患者TGFα-435G/A基因型與等位基因的分布與對照組之間并無顯著性差異，但是NAFLD患者中AA和GG基因型頻率（39.2%和16.3%）和等位基因頻率（61.4%和38.6%）與對照組之間（分別為25.7%和 35.3%，和45.2%和54.8%）存在顯著性差異（x2=15.43，P＜0.05；x2=16.32，P＜0.05）；進(jìn)一步的研究表明，不同程度NAFLD患者AA、AG、GG基因型頻率和等位基因頻率也存在一定的差異，即重度脂肪肝患者純合體（AA和GG）比例相對較高。結(jié)論TGFα-435G/A多肽位點(diǎn)基因突變與NAFLD患者發(fā)病之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，且不同基因型頻率和等位基因頻率與病情存在一定的相關(guān)性。

非酒精性脂肪性肝??；轉(zhuǎn)化生長因子α；基因多態(tài)性；基因型；等位基因

目前，脂肪肝已經(jīng)逐漸成為繼艾滋病、吸毒、酗酒之后的第四大醫(yī)學(xué)和社會問題[1]，并且已經(jīng)成為繼病毒性肝炎之后的第二大肝病?！?012年度世界衛(wèi)生統(tǒng)計報表》顯示，全球罹患脂肪肝的患者大約為1億3千萬人，并以每年將近1.4%速度迅速增長。根據(jù)我國對脂肪肝的調(diào)研結(jié)果顯示，截止到2014年我國罹患脂肪肝的患者總數(shù)大約在3400萬至3500萬之間，并以每年接近2.5%的速度遞增，說明我國面臨著較為嚴(yán)峻的脂肪肝防治形勢。Targher G et al[2]研究指出，脂肪肝的誘發(fā)因素很多，但是其最終結(jié)果都會導(dǎo)致人體肝細(xì)胞內(nèi)脂肪類物質(zhì)的非正常過量堆積，進(jìn)而引發(fā)疾病[3]。黃健[4]認(rèn)為非酒精性脂肪肝患者在脂肪肝患者當(dāng)中占有較大的比例，已經(jīng)成為研究治療脂肪肝的重要方向。非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無過量飲酒史，以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性以及脂類物質(zhì)富集作為主要特征的肝臟疾病[5]。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化生長因子（transfor ming growth factor-β1，TGF-β1）在人體內(nèi)可以直接參與肝臟等部位脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，或者通過相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制促使相關(guān)部位脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)移[6]，因此其可能與脂肪肝的形成以及惡化相關(guān)。葉曉光等[7]研究指出，TGFα與肝病的慢性化以及肝功能損害之間具有明顯的相關(guān)性，其在一定程度上可以作為檢測指標(biāo)。TGF-α和TGF-β對于慢性肝炎、肝硬化病情的判斷具有重要的臨床意義[8]。在本研究中，我們檢測了脂肪肝患者血清TGFα-435G/A基因多態(tài)性，以探討TGFα-435G/A基因多態(tài)性與脂肪肝之間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取我院自2013年2月至2015年2月收治的非酒精性脂肪肝患者126例作為研究對象，男性73例，女性53例，平均年齡（48.2±23.5）歲。上述患者均根據(jù)《肝臟病學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷。另選健康人121例，男性61名，女性60名，平均年齡（46.8±24.7）歲。

1.2 血清TGFα mRNA檢測 清晨抽取靜脈血8 ml，取4 ml放置于肝素抗凝管中，-80℃保存，用于DNA提取。剩余血液用于相關(guān)生化指標(biāo)檢測。引物設(shè)計及PCR反應(yīng)：應(yīng)用olige 7.0軟件對TGFα進(jìn)行引物設(shè)計，其序列如下：F：TGATGGGCGTGTGG AG，R：GTCGAGCCGGTGTGG。上述引物由上海生物工程有限公司合成。以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)（所用試劑均購自TAKARA公司)，其反應(yīng)體系（25 μl）如下所示：ddH2O 16.9 μl，10× Buffer 2.5μl，dNTP 2 μl（250 μmol/l），F(xiàn) 0.8 μl（0.5mmol/l），R 0.8 μl（0.5mmol/l），DNA 1 μl， DNA聚合酶（LA）1 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃5 min，95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃ 5 min，4℃。對獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后在凝膠成像儀下觀察?；蛐团袛啵喝∩鲜鯬CR產(chǎn)物5 μl，加入2 μl Pst1限制性內(nèi)切酶，然后加入2 μl 10×buffer和11 μl滅菌蒸餾水，37℃水浴1 h。取6 μl酶切后產(chǎn)物，加入1 μl 6×buffer，并在8%非變形聚丙烯酰胺凝膠中電泳1 h（100 V，40 mA），然后通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。PCR產(chǎn)物測序：隨機(jī)選取不同基因的野生型、雜合子和突變純合子各3例PCR產(chǎn)物。送交上海生工公司進(jìn)行測序與分析。

1.3 脂肪肝分度[9]1）輕度脂肪肝：在進(jìn)行B超檢測時，表現(xiàn)為近場回聲增強(qiáng)，遠(yuǎn)場回聲衰減不明顯，肝內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)仍然可見；2）中度脂肪肝：在B超檢測時，表現(xiàn)為前場回聲增強(qiáng)，后場回聲衰減，肝內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)模糊，患者有較為明顯的肝區(qū)不適，食欲不振現(xiàn)象；3）重度脂肪肝：在進(jìn)行B超檢測時，表現(xiàn)為近場回聲顯著增強(qiáng)，遠(yuǎn)場回聲明顯衰減，肝內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)無法辨認(rèn)，且患者肝區(qū)有明顯的疼痛感覺或黃疸，肝功能檢查顯示中度或者重度肝功能異常。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 等位基因頻率=（純合子例數(shù)× 2+雜合子例數(shù)）×2-1×n-1[9]。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGFα-435G/A基因PCR電泳及測序結(jié)果 對獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)Pst1限制性內(nèi)切酶（識別位點(diǎn)為CTGCAG）處理后電泳。TGFα-435G/G基因型能夠被Pst1限制性內(nèi)切酶切割，因此電泳之后其電泳結(jié)果有95 bp和73 bp兩個條帶。TGFα-435A/A基因型不能被Pst1限制性內(nèi)切酶切割，因此電泳后只有168 bp一個條帶。TGFα-435G/A基因型經(jīng)Pst1限制性內(nèi)切酶切割后有168 bp、95 bp和73 bp三個條帶（圖1A）。PCR酶切結(jié)果與測序結(jié)果一致（圖1B）。

2.2 NAFLD患者與健康人基因型頻率和等位基因頻率比較 對脂肪肝與健康人等位基因G、A頻率、基因型AA、GG頻率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果表明，兩組之間存在顯著性差異（x2=15.43，P＜0.05；x2=16.32，P＜0.05）。對兩組基因型頻率以及等位基因頻率驗(yàn)證結(jié)果表明其符合Hardy-Weinberg平衡定律（表1、表2）。

圖1 TGFα-435G/A基因PCR-RFLP電泳以及測序結(jié)果

表1 兩組TGFα-435G/A基因型頻率分布（%）比較

表2 兩組TGFα-435G/A等位基因頻率分布（%）比較

2.3 不同程度脂肪肝患者基因型頻率和等位基因頻率比較 對輕中重度脂肪肝患者基因型（AA、GG）頻率和等位基因（G、A）頻率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果表明不同程度脂肪肝患者之間在基因型和等位基因頻率之間存在顯著性差異（x2=16.45，P＜0.05；x2=15.78，P＜0.05），對脂肪肝患者基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果表明其符合Hardy-Weinberg平衡定律（表3、表4）。

表3 不同程度脂肪肝患者TGFα-435G/A基因型頻率分布（%）比較

表4 不同程度脂肪肝患者TGFα-435G/A等位基因頻率分布（%）比較

3 討論

相關(guān)文獻(xiàn)[10]研究證明，目前TGFα至少包含有TGFα1、TGFα2、TGFα3等3個亞型，且各個亞型之間堿基序列相差不大。Vongsuvanh R et al[11]指出，在TGFα這三個亞型當(dāng)中，相比于其他兩個亞型在人體中的含量而言，TGFα1蛋白在人體內(nèi)占有主要成分，這也導(dǎo)致在TGFα各個亞型之間TGFα1對人體的作用最為明顯。Avraham et al[12-14]研究表明TGFα基因位于17q12.6-q12.8，并且在1985年由Derynck[15]通過實(shí)驗(yàn)首次克隆得到，經(jīng)驗(yàn)證其含有7個外顯子。劉益娟等[16，17]通過相關(guān)臨床以及動物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，在人體內(nèi)TGFα是一類極為活躍的多功能的細(xì)胞因子，可以參與機(jī)體多項生命活動，例如業(yè)已有實(shí)驗(yàn)證明[18]，TGFα基因與創(chuàng)傷、器官纖維化、炎癥和腫瘤等的發(fā)生以及惡化存在一定的關(guān)聯(lián)性，在人體腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、受傷部位組織纖維化和發(fā)病初期的預(yù)防等方面均具有重要的作用。例如Dwan M[19]的研究表明，TGFα基因在癌癥以及腫瘤發(fā)生中可能扮演不同的角色。Nseir W研究表明[20]，在腫瘤前期TGFα可以通過對細(xì)胞周期的調(diào)控來抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制腫瘤的惡化，而在腫瘤發(fā)生中后期，其在一定程度上可以通過免疫抑制來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[21]。這些研究結(jié)果均表明TGFα可能在人體內(nèi)部腫瘤以及癌癥等疾病的發(fā)生以及惡化當(dāng)中發(fā)揮一定的作用，因此加深對TGFα在不同腫瘤中的研究并在此基礎(chǔ)上探究其與腫瘤細(xì)胞之間相互關(guān)系，對于腫瘤患者疾病的治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。近年來，隨著人們生活方式的不斷改變以及人們生活水平的不斷提升，在日常飲食當(dāng)中由于不良的飲食習(xí)慣例如過度飲酒、暴飲暴食等都會在很大程度上導(dǎo)致脂肪肝等疾病的產(chǎn)生，雖然目前已有大量實(shí)驗(yàn)表明TGFα與脂肪肝等疾病發(fā)病之間存在一定的相關(guān)性，但是對于TGFα多態(tài)性與脂肪肝之間相互關(guān)系的研究卻鮮見報道。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)脂肪肝患者 TGFα-435G/A基因型和等位基因分布與健康人之間存在顯著性差異（P＜0.05），說明脂肪肝的產(chǎn)生與TGFα基因型和等位基因的分布相關(guān)。對于不同基因型頻率和等位基因頻率的調(diào)查結(jié)果顯示，與正常人比，脂肪肝患者AA、GG基因型頻率和等位基因頻率存在顯著性差異，提示脂肪肝的產(chǎn)生與TGFα基因頻率和等位基因頻率存在密切的相關(guān)性。通過對不同程度脂肪肝患者的進(jìn)一步研究結(jié)果表明，不同程度脂肪肝患者TGFα基因頻率和等位基因頻率存在顯著性差異，重度脂肪肝患者純合體（AA、GG）比例相對較高，說明TGFα-435G/A基因多態(tài)性與非酒精性脂肪肝發(fā)病之間存在密切的相關(guān)性，即有較高的AA、AG、GG基因型頻率和等位基因頻率者，在一定程度上會促進(jìn)非酒精性脂肪肝的產(chǎn)生，而純合體（AA、GG）基因型頻率和等位基因頻率的升高在一定程度上會促進(jìn)非酒精性脂肪肝的惡化。由于研究時間短以及實(shí)驗(yàn)條件的限制，對于TGFα不同基因型頻率和等位基因頻率與非酒精性脂肪肝之間具體作用機(jī)制和方式方面還需要進(jìn)一步研究。

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（收稿：2015-11-20）

（本文編輯：陳從新）

Transforming growth factor-α-435G/A gene polymorphism in patients with nonalcoholic fatty liver diseases

Deng Jiazheng1，Shen Yang1，Ling Jing1，Deng Hong1，Le Yonghong2，Zhuang Xiaofang2.1 Department of Internal Medicine of Deyang People's Hospital，Deyang 618000，2 Department of Hepatology，Traditional Chinese Medicine Hospital，Urumqi 830000，Xinjiang Uygur Autonomous Region，China

ObjectiveTo study the transforming growth factor α（TGF-α）-435G/A gene polymorphism in patients with nonalcoholic fatty liver diseases（NAFLD）.Methods 126 patients with NAFLD between February 2013 and February 2015 were recruited in our hospital，and 121 healthy individuals were also included at the same time as control.The polymorphism of TGF-α-435G/A gene in peripheral blood was analyzed by restriction fragment length polymorphism （RFLP）and the data obtained were processed by SPSS software.Results There was no significant difference neither in the TGFα-435G/A genotypes nor the distribution of TGFα-435G/A allele between patients with NAFLD and control（P>0.05），however，there were significant differences in AA and GG genotype frequency（39.2%vs.25.7%，and 16.3%vs.35.3%）and their allele frequency（61.4%vs.45.2%，and 38.6%vs.54.8%）between the two groups（x2=15.43，P<0.05；x2=16.32，P<0.05）；And further study showed that patients with NAFLD with different steatosis had different AA GG，AG genotype frequencies and their allele frequencies with relatively high percentage of homozygote（AA，GG）in patients with severe fatty liver diseases. Conclusions There is a certain correlation between the gene mutation of TGFα-435G/A and the incidence of NAFLD，and the frequency of different genotypes and allele might be related to the severity of NAFLD.

Nonalcoholic fatty liver disease；Transforming growth factor α；Gene polymorphism；Genotype；Allele

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.017

618000四川省德陽市人民醫(yī)院消化內(nèi)科（鄧家征，申洋，凌晶，鄧宏，）；烏魯木齊市新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院肝病科（樂永紅，莊小芳）

鄧家征，男，43歲，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師。研究方向：消化內(nèi)科常見病診治研究。E-mail：254528425@qq.com