刁歡，張珍，余偉群，劉潔

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

微生物發(fā)酵提高黃芪中黃酮類物質(zhì)含量的研究

刁歡，張珍，余偉群，劉潔

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥 230088)

以黃芪為原料，研究微生物固態(tài)發(fā)酵對(duì)黃芪中黃酮含量的影響。采取單因素和正交試驗(yàn)，研究發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、菌種接種量、發(fā)酵pH值對(duì)黃芪中黃酮含量的影響。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間5d、接種量為2mL時(shí)發(fā)酵效果較好；再選擇其中影響顯著的因素設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，確定各因素水平的優(yōu)劣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝為A3B3C2，在該工藝條件下黃酮含量最高為0.586mg/g，是未發(fā)酵對(duì)照組(0.255mg/g)的2.29倍，增幅較大。

黃芪；微生物發(fā)酵；黃酮；含量

黃芪是一種益氣托毒的常用藥，有利尿、益氣固表、排膿等作用，其主要成分有黃酮、氨基酸、多糖、皂苷、微量元素等[1]。黃芪含有多種的黃酮類化合物，而黃酮在中醫(yī)領(lǐng)域驗(yàn)證可增強(qiáng)人體免疫功能、降低血糖、增強(qiáng)心肺功能和降血壓功能，同時(shí)還具有抗衰老、抗腫瘤等功效[2]。不少真菌在發(fā)酵的過(guò)程中產(chǎn)生多種酶類，且酶活力強(qiáng)[3]。將微生物的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于中藥發(fā)酵，就是利用微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的復(fù)雜酶系，一方面可以促進(jìn)中藥材中纖維、蛋白質(zhì)、糖類等成分的高效利用，還可以對(duì)某些特殊成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生出具有多種活性成分的制劑或新藥材，同時(shí)一些中藥還可能會(huì)促進(jìn)或抑制微生物的某些次生代謝產(chǎn)物的的產(chǎn)生[4]。郭羽等利用酵母菌發(fā)酵黃芪藥材，試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵對(duì)黃芪中多糖含量有一定影響，其產(chǎn)率與傳統(tǒng)法相比有提高[5]；郝紅梅等研究報(bào)道表明，利用酵母菌發(fā)酵黃芪可有效提高黃酮的產(chǎn)率[6]。陶蕾等研究黑曲霉發(fā)酵對(duì)黃柏中游離小檗堿影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)黑曲霉發(fā)酵會(huì)使黃柏中的游離小檗堿含量升高[7]。也有研究表明米曲霉發(fā)酵的紫米中總酚和總黃酮含量與對(duì)照組相比大幅提高，分別增加到93.0%和122.50%[8]。本研究以黑曲霉來(lái)發(fā)酵黃芪，以溫度、時(shí)間、pH值、黑曲霉接種量為影響發(fā)酵工藝研究的4個(gè)因素，設(shè)計(jì)單因素和正交試驗(yàn)，研究黑曲霉固態(tài)發(fā)酵黃芪的最佳條件，從而提高黃芪中黃酮的含量，具有深遠(yuǎn)的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。

1 材料與儀器

1.1 材料

黃芪選購(gòu)于市售藥房，產(chǎn)地為甘肅；黑曲霉來(lái)源于合肥學(xué)院生物系，血粉購(gòu)于南寧飼料市場(chǎng)，葡萄糖(AR)，瓊脂(AR)，蒸餾水，無(wú)菌水，亞硝酸鈉(AR)，磷酸氫二鉀(AR)，氯化鉀(AR)，硫酸鎂(AR)，氫氧化鈉(AR)，乙醇(AR)，硝酸鋁(AR)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)于合肥博美生物科技有限公司)。

1.2 儀器

FA2004型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司)，721分光光度計(jì)(南通市長(zhǎng)江光學(xué)儀器有限公司)，DPH120恒溫培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

1) 種子培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基) 土豆200g，切碎，煮沸，紗布過(guò)濾，加葡萄糖20g，溶液補(bǔ)充水至1000mL。115℃滅菌25min。

2)發(fā)酵培養(yǎng)基 稱取黃芪粉末10g，血粉2g，磷酸氫二鉀0.016g，硫酸鎂0.008g混勻置于50mL錐形瓶中，加蒸餾水16mL，攪拌均勻，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。

1.4 菌種活化

挑取斜面保存菌體，于50mL的液體PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化，活化時(shí)間24h，得到活化種子菌液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃酮提取方法

供試品制備采用乙醇回流提取法，參照文獻(xiàn)[6]：稱取黃芪10g于500mL的圓底燒瓶中，加70%乙醇溶液240mL混合，在80℃水浴下回流提取2h，趁熱抽濾，收集濾液，將殘?jiān)ㄟ^(guò)80%的乙醇溶液20mL洗滌，然后過(guò)濾，最后將濾液合并。將濾液轉(zhuǎn)移至100mL的容量瓶中，用30%的乙醇溶液定容，作為供試品，備用。

2.2 黃酮含量測(cè)定

1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取經(jīng)干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20mg，加30%的乙醇溶液溶解定容于50mL的容量瓶中，得到濃度為0.400g/L的蘆丁對(duì)照品溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作具體方法參照文獻(xiàn)[6]和文獻(xiàn)[9]。最后以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液定容好的溶液作參比，在波長(zhǎng)510nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得吸光度A與蘆丁濃度C(mg/mL)之間的線性回歸方程式為：A=13.175x-0.0342，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9968，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2)黃酮含量測(cè)定 參照1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液定容好的溶液作參比，在波長(zhǎng)510nm處用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。黃酮含量=原料中提取黃酮類物質(zhì)的總質(zhì)量/提取原料總重。根據(jù)公式計(jì)算得未經(jīng)發(fā)酵的對(duì)照組總黃酮的含量為0.255mg/g(以不經(jīng)發(fā)酵的黃芪作為對(duì)照組)。

2.3 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)考察

1)發(fā)酵溫度考察 以黑曲霉接種量2mL，發(fā)酵時(shí)間為5d，pH=5，分別在26、28、30、32、34℃下進(jìn)行培養(yǎng)，以未經(jīng)發(fā)酵的黃芪作為對(duì)照組，研究發(fā)酵溫度對(duì)黃酮含量的影響。

2)發(fā)酵時(shí)間考察 以黑曲霉接種量2mL，發(fā)酵溫度為28℃，pH=5，分別進(jìn)行發(fā)酵1、3、5、7、9d的培養(yǎng)，以未經(jīng)發(fā)酵的黃芪作為對(duì)照組，研究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響。

3)發(fā)酵pH值考察 以黑曲霉接種量2mL，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵5d，分別在pH值為4、5、6、7、8下進(jìn)行培養(yǎng)，以未經(jīng)發(fā)酵的黃芪作為對(duì)照組，研究發(fā)酵pH值對(duì)黃酮含量的影響。

4)接種量考察 以發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時(shí)間為5d，發(fā)酵pH值為5，分別按照黑曲霉接種量(孢子數(shù)達(dá)到108的種子液)1、2、3、4、5mL進(jìn)行接種，以未經(jīng)發(fā)酵的黃芪作為對(duì)照組，研究不同黑曲霉接種量對(duì)黃酮含量的影響。

表1 因素與水平

2.4 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素基礎(chǔ)上，考察影響顯著的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、pH值3個(gè)因素對(duì)黃芪中總黃酮得率的影響，采用L9(33)正交設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

1)發(fā)酵溫度考察結(jié)果 發(fā)酵溫度對(duì)黃酮含量的影響結(jié)果，如圖2。由圖可知，在不同發(fā)酵溫度下，黃酮含量分別為0.274、0.538、0.453、0.581、0.532mg/g。隨著發(fā)酵溫度的提高，黃酮含量先增加后又降低，28℃和32℃的黃酮含量相對(duì)較高，32℃后呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成，都需要各種酶來(lái)催化。溫度是影響酶活的重要因素，溫度升高，酶活反應(yīng)速度加快。但與之相反，酶也容易因?yàn)槭軣岫セ钚?，最終會(huì)減少物質(zhì)產(chǎn)量。發(fā)酵溫度在32℃時(shí)黃酮含量最高，是對(duì)照組的2.28倍，28～32 ℃可能是相對(duì)比較適合的發(fā)酵溫度范圍。

2)發(fā)酵時(shí)間考察結(jié)果 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響結(jié)果，見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，不同發(fā)酵時(shí)間里，黃酮含量分別為0.334、0.533、0.584、0.371、0.211mg/g。隨著時(shí)間增加，1～3d黃酮含量大幅增加，3～5d時(shí)含量增加平穩(wěn)，第5天含量最高達(dá)0.584mg/g。但是發(fā)酵天數(shù)達(dá)到5d以后，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，黃酮含量卻顯著下降。發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵結(jié)果的一個(gè)重要因素，發(fā)酵時(shí)間短，微生物產(chǎn)生酶量相對(duì)較少；相反發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，培養(yǎng)基所能提供的養(yǎng)分不足以及細(xì)胞衰亡，有可能會(huì)使產(chǎn)酶的性能下降，影響產(chǎn)量。因此本實(shí)驗(yàn)較適宜的發(fā)酵天數(shù)為3～5d。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)黃酮含量的影響 圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響

3)發(fā)酵pH值考察結(jié)果 發(fā)酵pH值對(duì)黃酮含量的影響結(jié)果，如圖4。由圖4可以看出，不同pH值條件下，黃酮含量分別為0.351、0.559、0.564、0.477、0.263mg/g。pH值4～6，黃酮含量有較明顯的增長(zhǎng)，在發(fā)酵pH=6時(shí)含量最大，是對(duì)照組的2.2倍。pH值7～8時(shí)，含量出現(xiàn)明顯下降，說(shuō)明較適宜的發(fā)酵條件應(yīng)偏酸性。

4)黑曲霉接種量考察結(jié)果 黑曲霉接種量對(duì)黃酮含量的影響結(jié)果，如圖5。由圖5可以看出，不同接種量條件下，黃酮含量分別為0.255、0.548、0.553、0.551、0.549mg/g。在黑曲霉接種量2～5mL，增加接種量對(duì)黃酮含量無(wú)顯著影響。菌種接種量是相對(duì)于發(fā)酵量而言的，在發(fā)酵量一定的條件下，增加菌種的接種量，會(huì)使含量有所提高。但是隨著接種量的一直增加，當(dāng)達(dá)到較適宜的比例時(shí)，便不會(huì)有所提高。因此本著節(jié)約資源，充分利用的原則，本實(shí)驗(yàn)接種量范圍選擇2mL。

圖4 發(fā)酵pH值對(duì)黃酮含量的影響 圖5 黑曲霉接種量對(duì)黃酮含量的影響

實(shí)驗(yàn)號(hào)因素A溫度/℃B時(shí)間/dC(pH)黃酮含量/(mg·g-1)11110.25121220.47831330.52542120.45852230.32462310.47273130.56383210.47193320.586k11.2541.2721.194k21.2541.2731.522k31.621.5831.412R0.3660.3110.328

3.2 正交試驗(yàn)考察結(jié)果

研究最佳發(fā)酵工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了三因素、三水平的正交試驗(yàn)，采用L9(33)方案設(shè)計(jì)， 以得出固態(tài)發(fā)酵黃芪黃酮含量的最佳發(fā)酵工藝。 正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2 。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果確定各因素水平的優(yōu)劣，最佳試驗(yàn)方案是A3B3C2；因素影響程度的主次依次為A>C>B。最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間為5d、發(fā)酵pH值為6，最佳發(fā)酵工藝下黃酮含量最高為0.586mg/g，與對(duì)照組相比，提高2.29倍。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果作方差分析，結(jié)果表明各因素間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 方差分析表

4 討論

黑曲霉發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生多種活性較強(qiáng)的酶系，如淀粉酶、酸性蛋白酶等[9]，細(xì)胞壁的纖維等物質(zhì)會(huì)被這些豐富的酶系代謝，可能會(huì)促進(jìn)黃酮的釋放。經(jīng)微生物發(fā)酵后黃芪中黃酮的含量有所增高，發(fā)酵后期菌種可能代謝出了黃酮類成分，而另一部分黃酮被消耗或是經(jīng)修飾轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，所以黃酮含量不會(huì)一直增加，還有可能會(huì)下降[6]。發(fā)酵溫度對(duì)黃酮含量影響較大，隨著溫度的升高，發(fā)酵過(guò)程中可能破壞了黃芪細(xì)胞壁的完整性，提高了細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)了黃酮的釋放；發(fā)酵溫度高于32℃時(shí)不適宜黑曲霉菌絲體的生長(zhǎng)，也會(huì)破壞菌種中酶的活性，使得黃酮的含量反而降低。黑曲霉的生長(zhǎng)和發(fā)酵過(guò)程中需要偏酸的環(huán)境，且也可能會(huì)代謝出一些有機(jī)酸，所以偏酸性的pH值環(huán)境比較適合黃芪的發(fā)酵。黃芪發(fā)酵過(guò)程中，黑曲霉產(chǎn)生代謝反應(yīng)復(fù)雜多樣[10]，且黃芪本身含有的活性成分很多，而藥效作用是由活性物質(zhì)決定，所以還應(yīng)進(jìn)一步的探討，驗(yàn)證發(fā)酵的深層次結(jié)果。

黃芪中的有效成分較多，本試驗(yàn)僅對(duì)黃芪發(fā)酵后黃酮含的量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，黑曲霉發(fā)酵處理可使黃芪總黃酮含量有明顯的提高。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，獲得最佳發(fā)酵工藝A3B3C2，即發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間5～d、發(fā)酵pH值為6，最佳發(fā)酵工藝下黃酮含量最高為0.586mg/g，與對(duì)照組相比，提高2.29倍。

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[編輯] 一凡

2017-01-03

2015年國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA710052)；2015年安徽省省級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(AH201512216003、AH201512216004)；安徽省級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目(2015ckjh115)。

刁歡(1982-)，女，講師，博士生，主要從事微生物發(fā)酵研究，532045301@qq.com。

R282.7;R917

A

1673-1409(2017)08-0004-04

[引著格式]刁歡，張珍，余偉群，等.微生物發(fā)酵提高黃芪中黃酮類物質(zhì)含量的研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(8)：4～7.