趙領軍

ABO血型基因變異體引起正反定型不合1例

趙領軍

目的 采用分子生物學技術分析ABO血型鑒定正反定型不合1例，為保障患者的輸血安全提供依據(jù)。方法ABO血型血清學鑒定采用微柱凝膠法。提取全血DNA，用序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCR-SSP）進行ABO基因分型；用PCR法擴增ABO基因1～7號外顯子進行直接測序，測序結果與A101序列進行比較。結果 患者血型表現(xiàn)為正反定型不符，正向鑒定為O型，反向鑒定僅發(fā)現(xiàn)有抗-B凝集素，結果為A型?；颊呒t細胞和抗-AB單克隆抗體有微弱的凝集。ABO PCRSSP基因分型表明患者為雜合O1/A基因型，進一步對外顯子擴增測序發(fā)現(xiàn)ABO第6外顯子存在248A＞G誤義突變，導致糖基轉移酶83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。用自行設計的引物采用PCR-SSP法對350例獻血者進行248A＞G突變頻率調查，未發(fā)現(xiàn)陽性。結論 ABO基因248A＞G變異體和缺乏抗-A 凝集素以及A抗原極低水平表達相關。

ABO血型 基因分型 序列特異性引物聚合酶鏈反應 DNA測序 基因變異體

【Key words】 ABO blood group Genotyping PCR-SSP DNA sequencing Gene variant

ABO血型的正確鑒定對于臨床安全輸血具有極其重要的意義，錯誤的血型鑒定可導致受血者發(fā)生溶血性輸血反應，嚴重者可能危及生命。研究表明，ABO血型基因型和表型直接相關[1，2]，多數(shù)基因變異體表現(xiàn)為一個或多個單核苷酸突變，導致編碼的氨基酸改變或提前引入終止密碼子。這些基因水平的改變分布在ABO基因的整個編碼區(qū)，可導致A抗原或B抗原的表達減弱，甚至完全沒有表達。血型抗原表達的差異會導致臨床血型鑒定正反定型不符，干擾血型鑒定，從而影響臨床輸血安全?，F(xiàn)對1例血型正反向鑒定不符病例進行ABO基因型分析，報告如下。

對象與方法

1 研究對象 患者，58歲，女性，因外周動脈阻塞性疾病來本院治療。對其血型鑒定時發(fā)現(xiàn)正反向定型不符，正向鑒定為O型，反向鑒定為A型?；颊邿o大量輸血史和血液干細胞移植記錄，對其ABO基因型進行了分析。

2 方法

2.1 標本采集：采集患者靜脈血標本，EDTA抗凝，用于血型鑒定和抽提基因組DNA。

2.2 血型血清學實驗：應用微柱凝膠法進行ABO血型鑒定，實驗方法參照文獻[3]。

2.3 試劑和儀器：血型鑒定抗體和人ABO血型反向定型應用上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司產紅細胞試劑盒。快速抽提血液基因組試劑盒為上海生工生物有限公司產品。引物序列設計參照文獻[4]，由華大基因公司合成（表1）。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑為C-TaKaRa （大連寶生物）公司產品。應用Bio-rad C1000 Thermal Cycle PCR擴增儀。ABO PCR-SSP基因分型試劑盒（Inno-Train）購自阿爾沃科技有限公司。

2.4 DNA提取和ABO基因分型：從患者全血中提取基因組DNA及ABO PCR–SSP基因分型，實驗操作均按照試劑盒說明書進行。擴增ABO 1～7號外顯子、內含子區(qū)序列，總反應體系為25 μl，其中Taq High Fidelity DNA 聚合酶（5 U/μl） 0.2 μl，10×reaction buffer 2.5 μl，dNTP mix （10 mmol/μl） 2 μl，上下游引物（10 mmol/μl）各1 μl，DNA模板 1 μl以及ddH2O 17.3 μl。擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 變性30 s，62℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，35個循環(huán)； 72 ℃ 5 min。反應產物經(jīng)2.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析，溴乙錠染色照相。純化的PCR反應產物由華大基因公司測序，測序結果與血型基因變異位點數(shù)據(jù)庫（Blood Group Antigen Gene Mutation Database）[5]比對，以A101為標準序列判斷其血型基因型。

表1 PCR擴增引物序列

結 果

1 血型血清學實驗結果 患者紅細胞在常規(guī)微柱凝膠法正向血型抗原鑒定中，A抗原和B抗原均為陰性，血型鑒定為O型（圖1A）。但反向血型鑒定中，患者血清只與B診斷紅細胞凝集呈強陽性（抗-B凝集素），不凝集A1、A2和O診斷紅細胞，血型鑒定為A型（圖1B）。進一步用單克隆血型抗體對其紅細胞進行抗原鑒定，觀察到患者紅細胞只和抗-AB單克隆抗體有微弱的凝集（圖1C）。該患者缺失抗-A凝集素，且有極低水平的A抗原表達，提示有ABO等位基因變異。

2 ABO血型基因分型結果 應用PCR-SSP試劑盒對患者進行ABO基因分型，可觀察到患者表現(xiàn)為雜合O1/A基因型[4]（圖2）。此外，發(fā)現(xiàn)O1和nonO1等位基因特異引物PCR擴增產物量之間有明顯差別，nonO1電泳帶（泳道1）的亮度顯著低于O1（泳道2），提示可能有A等位基因變異體的存在。然而，用PCR-SSP法分析了幾種常見的ABO等位基因變異體，結果均為陰性。

圖1 微柱凝膠法ABO血型鑒定結果

圖2 ABO PCR-SSP基因分型結果

為確定患者的ABO基因序列變異，本研究采用PCR法對ABO基因外顯子進行擴增和測序，并將結果和A101標準序列比對。序列分析顯示患者ABO基因第6外顯子存在雜合261delG（O1等位基因），進一步證實為雜合O1/A（圖3）；此外還發(fā)現(xiàn)第6外顯子存在一個新的248A＞G突變，且該突變有雜合現(xiàn)象（圖3）。248A＞G突變在序列上靠近261G，位于特異引物結合靶位區(qū)內，因此可影響引物結合DNA模板。上述PCR-SSP分析后觀察到nonO1特異引物產物顯著低于O1特異引物，說明該突變會影響261G特異引物和模板結合（A/G mismatch），但是不影響261delG特異引物與模板結合。據(jù)此，248A＞G突變應和O1等位基因的261delG呈反式構型（in trans），而和nonO1等位基因的261G呈順式構型（cis）。進一步推測248A＞G突變位于A等位基因上，導致其編碼的糖基轉移酶83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。

為研究ABO基因第6外顯子248A＞G基因變異體在人群中的頻率，隨機選擇了邢臺市350名獻血者，自行設計引物（表1）進行ABO PCR-SSP分析，但是未發(fā)現(xiàn)一例陽性（圖4）。

討 論

人類ABO血型基因定位于第9號染色體，由7個外顯子組成。其中第6號和第7號外顯子編碼糖基轉移酶的主要部分，包括催化區(qū)域，因而直接影響A抗原和B抗原的表達[6]。以往研究表明正反向血型鑒定不合往往提示有ABO等位基因變異，常導致發(fā)現(xiàn)新的基因變異體[7，8]。在本例患者血型鑒定中我們發(fā)現(xiàn)正反向定型不合，正向結果為O型，但在反向鑒定中僅發(fā)現(xiàn)抗-B凝集素，結果為A型；進一步分析發(fā)現(xiàn)其紅細胞和單克隆抗-AB抗體有微弱的凝集，表明有極低水平的A抗原表達。因此，進一步分析ABO基因型。

圖3 患者ABO基因第6外顯子序列分析

圖4 PCR-SSP分析248A＞G突變

分析結果表明，該患者ABO基因呈現(xiàn)出雜合O1/A基因型，且存在雜合的第6外顯子248A＞G突變，該突變和261G（non O1等位基因）呈順式（cis）構型，和261delG（O1等位基因）呈反式（in trans）構型。我們推測248A＞G突變導致糖基轉移酶的第6外顯子編碼的83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。由于這兩個氨基酸性質差別極大，因此這個改變會對糖基轉移酶活性產生重要影響。Yu等[9]曾報道在國人B3表型個體中，發(fā)現(xiàn)存在247G＞T突變，導致同一位點83位天冬氨酸被酪氨酸替代（Asp83Tyr）。許先國等[10]報道的Bw12表型中存在278C＞T突變，導致93位脯氨酸被亮氨酸替代（Pro93Leu）。根據(jù)這些結果，我們推斷糖基轉移酶的83～93位氨基酸對于酶的正?；钚灾陵P重要，這些位置的氨基酸替代可以減弱A抗原或B抗原的表達，或者導致完全不表達。

我們的調查表明新發(fā)現(xiàn)的248A＞G突變在人群中的頻率極低，然而明確該患者的ABO基因型對于輸血和血型診斷有重要意義。盡管沒有抗-A抗體，但因為不能完全排除A抗原免疫，對于攜帶有248A＞G基因變異體的患者，建議輸入O型成分紅細胞。另一方面，攜帶有該基因變異體的獻血者應該歸類于A型血，因為殘存的A抗原可能會和受血者抗-A抗體結合，引起免疫反應。綜上所述，鑒定ABO血型基因變異體可以促進了解遺傳因素對血型的影響，對增進輸血安全具有重要意義。

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A Case Report of Forward/Reverse Blood Grouping Discrepancy Resulting from ABO Gene Variant

ZHAO Lingjun.
Department of Clinical Laboratory，The Third Hospital of Xingtai City，Xingtai 054000

Objective To analyze a discrepancy in results of forward/reverse ABO blood grouping with molecular analysis and provide knowledge for safe blood transfusion. Methods Column gel testing was used for serological ABO blood grouping. Genomic DNA was extracted from whole blood and PCR-SSP was used for ABO genotyping. PCR was performed to amplify ABO exons 1 to 7 and the amplification products were sequenced directly. The obtained sequences were compared with wild type A101 to identify sequence variation. Results Blood grouping indicated the discrepant results of forward/reverse ABO typing. Forward typing produced blood group O，while reverse typing produced blood group A as only anti-B isoagglutinins were present. A monoclonal anti-AB antibody detection revealed a weak agglutination with patient's RBCs. ABO genotyping with PCR-SSP indicated a heterozygous O1/A type，and further PCR and ABO exons sequencing identified a new 248A＞G missense mutation in exon 6，which led to the replacement of Aspartate at position 83 with glycine. PCR-SSP using newly designed 248A＞G mutation-specific primer was performed to investigate the frequency of this new mutation among regular blood donors but none turned out to be positive. Conclusions This ABO gene 248A＞G mutation is associated with the absence of anti-A isoagglutinins and weak A antigen expression.

R457.1+1 R392.11

A

1671-2587（2017）02-0178-05

2016-12-22 ）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.025

054000 河北省邢臺市第三醫(yī)院檢驗科

趙領軍（1964–），女，河北邢臺人，副主任檢驗技師，學士，主要從事臨床輸血及相關研究，（Tel）0319-2206073（E-mail）hbyml@sina.com。