林 紅 邵 雷

江蘇地區(qū)漢族人群HLA-E基因多態(tài)性分析*

林 紅 邵 雷

目的 通過調(diào)查江蘇地區(qū)漢族人群人類白細(xì)胞抗原-E（ HLA-E） 等位基因多態(tài)性分布情況，為探討HLA -E基因多態(tài)性與疾病關(guān)聯(lián)奠定基礎(chǔ)。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)－序列特異性引物（ PCR-SSP） 方法，調(diào)查217例江蘇地區(qū)漢族獻(xiàn)血人群HLA-E的表達(dá)。結(jié)果 檢測到HLA-E 的2個等位基因，分別是HLA-E*01：01和HLA-E*01：03，分布頻率為41.47%和58.53%；基因型HLA-E*01：01/01：01、01：01/01：03和01：03/01：03的頻率分別為14.74%、53.46%和31.80%，分布符合Hardy-weinberg 平衡定律。結(jié)論 江蘇地區(qū)漢族人群HLA-E高度保守，僅有2種基因型。

人類白細(xì)胞抗原 HLA-E 位點 基因多態(tài)性

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）位于第6 號染色體短臂（6p21.3），其中HLA-Ⅰ類基因由經(jīng)典HLA-Ⅰ類基因（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和非經(jīng)典HLA-Ⅰ類基因（HLA-E、HLA-F、HLA-G）組成[1]。與經(jīng)典HLA-Ⅰ類基因相比，HLA-E 基因多態(tài)性有限，以HLA-E*01：01 和HLA-E*01：03 為主[2]。HLA-E 為NK 細(xì)胞上受體CD94/NKG2A、CD94/ NKG2C的配體，且CD8+T 細(xì)胞通過T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR） 與HLA-E 及抗原肽復(fù)合物雙識別，因此HLA-E 在天然免疫及獲得性免疫的調(diào)節(jié)中均發(fā)揮重要作用[3]。越來越多研究表明，HLA-E 分子與造血干細(xì)胞移植效果、腫瘤免疫、生殖免疫、機(jī)體抗感染顯著相關(guān)，HLA-E已成為當(dāng)前免疫遺傳學(xué)研究熱點之一。本研究旨在檢測江蘇地區(qū)獻(xiàn)血人群HLA-E 等位基因多態(tài)性的分布，并與其他不同地區(qū)和種族人群進(jìn)行比較，以期豐富人類基因庫數(shù)據(jù)，為探討HLA-E 與疾病關(guān)聯(lián)研究、臨床移植等提供重要參考。

對象與方法

1 對象 來自江蘇省血液中心217 例無血緣關(guān)系的漢族合格獻(xiàn)血者，年齡18～55歲，男110例，女107例。標(biāo)本為EDTA 抗凝外周全血5 ml，提取白膜后統(tǒng)一凍存于–30℃冰箱備用。

2 基因組DNA提取 按照Axygen Blood DNA Kit說明書進(jìn)行基因組DNA提取。DNA濃度≥80 mg/ L，純度為A260/280=1.65～1.90。

3 引物合成 參照文獻(xiàn)[1]方法，設(shè)計擴(kuò)增HLA-E基因的PCR-SSP分型引物。所有引物均由南京金斯瑞生物技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系均為10 μl，其中2×PCR Mix 5 μl，引物各0.5 μl，模板1.0 μl，H2O 3 μl。循環(huán)條件：96℃ 1min；96℃25 s，65℃ 45 s，72℃ 30 s，7個循環(huán)；96℃ 25s，60℃ 45 s，72℃ 30 s，21個循環(huán)；96℃ 25 s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，5個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE緩沖液中電泳（100V，30 min） ，通過凝膠電泳成像系統(tǒng)觀察基因擴(kuò)增結(jié)果。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用直接計數(shù)法，計算基因型頻率和基因頻率；對HLA-E基因型分布進(jìn)行Hardyweinberg平衡檢驗，與其他地區(qū)HLA-E基因型分布的比較采用卡方檢驗。

結(jié) 果

1 江蘇地區(qū)人群HLA-E基因多態(tài)性分布 江蘇漢族271例無償獻(xiàn)血者中，檢出2種等位基因：HLAE*01：01 和HLA-E* 01：03，等位基因頻率分別為41.47%和58.53%（表1）；未檢出HLAE*01：04基因。3種基因型HLA-E*01：01/01：01、01：01/01：03和01：03/01：03的頻率分別為14.74%、53.46%和31.80%，基因型分布符合Hardy-weinberg平衡定律（χ2=2.22，P=0.136）。2 江蘇地區(qū)漢族人群HLA-E基因分布與其他民族和地區(qū)HLA-E的比較見表1。等位基因HLAE*01：01和HLA-E*01：03與河北和南方漢族人群及內(nèi)蒙古漢族人群的分布一致，均為HLAE*01：01小于HLA-E*01：03的表達(dá)頻率；而在蒙古族人群中HLA-E*01：01和HLA-E*01：03的表達(dá)頻率接近，與江蘇漢族人群相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

江蘇人群的HLA-E基因表達(dá)與日本人群相比，日本人群HLA-E* 01：03 等位基因頻率明顯高于HLA-E* 01：01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；但與泰國和韓國人群相比，均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在非洲裔人群和歐洲人群中，HLA-E* 01：01 等位基因頻率明顯高于HLA-E*01：03，江蘇人群的基因型分布與之相比，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 HLA-E基因型在不同地區(qū)和國家的分布比較

討 論

HLA-E 基因由7個內(nèi)含子和8個外顯子組成，是最保守的HLA。HLA-E基因多態(tài)性主要集中在第2和3外顯子，分別編碼3種不同的蛋白質(zhì)分子。HLA-E*01：03與HLA-E*01：01的差異在于在外顯子3的第107個密碼子A取代了G，使精氨酸（AGG，R）變?yōu)楦拾彼幔℅GG，G）。HLA-E*0104 包括2個非同義突變，第1個與HLAE*01：03相同，第2個在外顯子3的第157個密碼子，精氨酸（AGA，R）變?yōu)楦拾彼幔℅GA）[11]。

HLA-E 等位基因構(gòu)成及基因頻率在不同人群中有一定差異。HLA-E 群體遺傳學(xué)研究表明，HLA-E*01：01 和*01：03 存在于全球多個種族人群中，且在亞洲人群、高加索人群和非洲人群中均未檢測出E*0102和E*0104[11]；HLA-E* 0102已被證實與E*01：01：01：01的DNA序列一致[12]；另外，人們懷疑E*01：04 等位基因是人工合成的序列。本實驗采用最快捷和經(jīng)濟(jì)的PCR-SSP方法檢測HLA-E*01：01、*01：03和*01：04，發(fā)現(xiàn)江蘇漢族人群HLA-E有2個等位基因（HLA-E*01：01和*01：03）及3個基因型（HLA-E*01：01/01：01、HLA-E*01：01/01：03和HLA-E*01：03/01：03），其遺傳特點符合Hardy-Weinberg 平衡。

江蘇漢族人群中HLA-E基因型表達(dá)與中國其他地區(qū)漢族人群的研究結(jié)果一致，都是HLAE*01：03的頻率高于HLA-E*01：01，而蒙古族人群中2種等位基因頻率接近，但與漢族人群比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。亞洲人群普遍HLAE*01：03的頻率高于HLA-E*01：01，且不同國家人群之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。非洲裔和歐洲人群的HLA-E*01：01頻率高于HLA-E*01：03，與江蘇人群HLA-E基因型分布相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所以，本實驗結(jié)果再次證實HLA-E限制性多態(tài)性和高度保守的特點，其基因型在人群中的分布較穩(wěn)定。千人基因組計劃（1 000 Genomes） 也顯示HLA-E基因有33個單倍體，編碼HLA-E*01：01或HLA- E*01：03蛋白的2個基因型DNA序列占98.2%，說明HLA-E在免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[13]。近年來非經(jīng)典HLA-I分子在病毒感染[14]、腫瘤免疫[15]和移植[16]中的作用越來越受到重視。因此，在不同人群和種族調(diào)查HLA-E等位基因的分布及HLA-E 與疾病的關(guān)聯(lián)是今后的研究方向。

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Polymorphic Analysis of HLA-E Gene in Han Population of Jiangsu Province

LIN Hong，SHAO Lei.
Jiangsu Province Blood Center 210042

Objective To investigate the genetic polymorphisms of HLA-E locus in Han population of Jiangsu region． Methods The genomic DNA extracted from 217 unrelated healthy blood donors were amplified by using HLA-E specific PCR primers．Results Two alleles including HLA-E* 01：01 and HLA-E* 01：03 were identified，the frequencies were 41.47% and 58.53%，respectively．The frequencies of the three HLA-E genotypes（HLA-E*01：01/01：01，01：01/01：03 and 01：03/01：03）were 14.74%，53.46% and 31.80%，respectively，and they were in accordance with Hardy-Weinberg Equilibrium． Conclusion The polymorphism of HLA-E in the Han population of Jiangsu province was highly conserved，suggesting a role of HLA-E in disease association and clinical transplantation.

Human leukocyte antigens HLA-E locus Genetic polymorphisms

R392.11

A

1671-2587（2017）02-0173-03

2016-12-12）

（本文編輯：王虹）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.023

*本課題受江蘇省“六大人才高峰”項目（No.WSN-2014-002）資助

210042 南京，江蘇省血液中心

林紅（1971–），女，江蘇揚州人，研究員，主要從事輸血安全研究，（Tel）13813885346（E-mail）linhong712003@sina.com。