林詩(shī)雅 王 淏 李仲平 梁浩堅(jiān) 謝君謀 肖韶英 鄭優(yōu)榮

2015年廣州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者核酸和ELISA檢測(cè)結(jié)果分析

林詩(shī)雅 王 淏 李仲平 梁浩堅(jiān) 謝君謀 肖韶英 鄭優(yōu)榮

目的 分析2015年廣州血液中心無(wú)償獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)（NAT）和ELISA的篩查結(jié)果，探討NAT和ELISA并行的血液篩查模式下，兩種檢測(cè)方法在降低輸血相關(guān)病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。方法 采用兩種ELISA試劑和單人份核酸檢測(cè)（ID-NAT）平行應(yīng)用的血液篩查模式，對(duì)2015年廣州市無(wú)償獻(xiàn)血者HBV、HCV和HIV血清學(xué)標(biāo)志物及其病毒核酸進(jìn)行篩查。核酸初檢陽(yáng)性標(biāo)本取其血袋血漿進(jìn)一步做核酸鑒別實(shí)驗(yàn)。對(duì)HIV-1 RNA鑒別陽(yáng)性、ELISA陰性的獻(xiàn)血者進(jìn)行追蹤隨訪。結(jié)果 本中心2015年核酸檢測(cè)標(biāo)本合計(jì)300 250例，其中初檢陽(yáng)性2 874例，總陽(yáng)性率0.96%；核酸初檢單陽(yáng)性628例，單陽(yáng)性率0.21%；鑒別陽(yáng)性數(shù)129例，總陽(yáng)性率20.58%，鑒別陽(yáng)性中127例HBV、2例HIV，未發(fā)現(xiàn)HCV陽(yáng)性，其中1例HIV-1 RNA單陽(yáng)性隨訪標(biāo)本送廣州市疾控中心經(jīng)確證為陽(yáng)性。酶免HBV、HCV和HIV與核酸檢測(cè)結(jié)果比較顯示：核酸與酶免HBV、HCV和HIV檢測(cè)均為陽(yáng)性共2 204例，2 333例HBV ELISA雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本中78%（1 829/2 333）核酸陽(yáng)性；343例HCV ELISA雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本中66%（226/343）核酸陽(yáng)性；92例HIV ELISA雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本中全部為核酸陽(yáng)性。酶免單試劑陽(yáng)性標(biāo)本中6%（57/901）為核酸陽(yáng)性，94%（844/901）為核酸陰性。酶免雙試劑陽(yáng)性中核酸陽(yáng)性比例大于酶免單試劑陽(yáng)性（P＜0.05）。結(jié)論 核酸檢測(cè)能更進(jìn)一步縮短輸血傳播疾病的檢測(cè)“窗口期”，發(fā)現(xiàn)隱匿性病毒感染，核酸和酶免檢測(cè)在降低輸血相關(guān)病毒感染風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮重要的互補(bǔ)作用。

核酸擴(kuò)增檢 隱匿性HBV感染 窗口期 無(wú)償獻(xiàn)血

核酸擴(kuò)增檢測(cè)（ nucleicacid amplification testing，NAT） 是通過(guò)擴(kuò)增病原體核酸進(jìn)行檢測(cè)的一系列技術(shù)總稱。與血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)ELISA相比，NAT技術(shù)靈敏度較高，可直接檢測(cè)病原體核酸，是血液中病原體存在的最直接證據(jù)。Busch等[1]研究證實(shí)核酸檢測(cè)能將HBV、HCV和HIV血清學(xué)檢測(cè)的窗口期分別縮短20天、50天和10天。歐美等許多國(guó)家和地區(qū)已將NAT技術(shù)應(yīng)用于獻(xiàn)血者血液篩查[2]。近年來(lái)，我國(guó)核酸檢測(cè)工作也取得了較滿意的效果[3]，本中心自2010年采用NAT和ELISA并行檢測(cè)的篩查策略，現(xiàn)回顧性分析2015年核酸和酶免檢測(cè)情況，報(bào)告如下。

資料與方法

1 研究對(duì)象和標(biāo)本處理 標(biāo)本來(lái)自2015年1月1日～12月31日廣州血液中心無(wú)償獻(xiàn)血者，獻(xiàn)血者經(jīng)HBsAg（膠體金法）和ALT（速率法）快速篩查為合格，且符合《獻(xiàn)血者健康檢查標(biāo)準(zhǔn)》（GB18457-2012）。每位獻(xiàn)血者采用EDTA-K2真空抗凝管留取2管各5 ml血液，核酸檢測(cè)標(biāo)本使用帶分離膠的真空抗凝管留取。所有標(biāo)本在采血后4 h內(nèi)（1 600 g，12 min）離心，運(yùn)輸溫度控制在2℃～8℃，24 h內(nèi)檢測(cè)。獻(xiàn)血者跟蹤采樣采用帶分離膠真空抗凝管留取5 ml，核酸初檢陽(yáng)性標(biāo)本取血袋血漿進(jìn)行核酸拆分實(shí)驗(yàn)。

2 ELISA篩查試劑與儀器 每個(gè)ELISA項(xiàng)目采用兩種試劑盒進(jìn)行篩查，HBsAg：上?？迫A、北京萬(wàn)泰；抗-HCV：上?？迫A、珠海麗珠；HIV抗原/抗體：法國(guó)伯樂(lè)；HIV抗原：北京萬(wàn)泰。均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)操作。儀器：ML-STAR加樣儀（瑞士HAMILTON），后處理使用FAME 24/30全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀（瑞士 HAMILTON），340a酶標(biāo)儀（奧地利Anthos）等。

3 核酸檢測(cè)試劑與儀器 應(yīng)用TIGRIS全自動(dòng)血液核酸檢測(cè)儀（美國(guó)諾華公司），配套試劑為Procleix Ultrio assay，核酸鑒別試劑：Procleix Ultrio Discriminatory Assay。

4 檢測(cè)策略及檢測(cè)結(jié)果判定 應(yīng)用NAT和ELISA法對(duì)標(biāo)本并行檢測(cè)，ELISA結(jié)果＜Cut off值判為陰性，結(jié)果≥Cut off值判為陽(yáng)性。兩種試劑均呈陰性則為合格，兩種試劑均呈陽(yáng)性則為不合格，若其中一種試劑結(jié)果為陽(yáng)性，則該項(xiàng)目用兩種試劑各復(fù)檢兩孔，均為陰性者則為合格，其中一種為陽(yáng)性判為不合格。NAT可同時(shí)檢測(cè)HBV、HCV和HIV-1 3種病毒核酸，反應(yīng)性結(jié)果表明其中有1～3種病毒核酸為陽(yáng)性。初次檢測(cè)反應(yīng)性標(biāo)本取血漿袋中血漿分別做HBV、HCV和HIV-1的鑒別檢測(cè)，核酸鑒別試驗(yàn)呈反應(yīng)性，判定標(biāo)本為該鑒別項(xiàng)目陽(yáng)性；若核酸鑒別試驗(yàn)呈無(wú)反應(yīng)性，則判為鑒別實(shí)驗(yàn)陰性。

5 HIV-1 RNA陽(yáng)性標(biāo)本的追蹤與定量 對(duì)核酸檢測(cè)HIV-1RNA陽(yáng)性的獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血后追蹤采樣。嚴(yán)格按照《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》對(duì)標(biāo)本進(jìn)行采集處理，同時(shí)應(yīng)用上述儀器方法進(jìn)行NAT和ELISA檢測(cè)，并送廣州市疾病預(yù)防控制中心用免疫印跡法（Western blot，WB）進(jìn)行抗體確證試驗(yàn)。對(duì)HIV-1 RNA陽(yáng)性、ELISA陰性標(biāo)本及其跟蹤標(biāo)本進(jìn)行病毒定量。HIV定量試劑：Cobas?AmpliPrep/COMBAS TaqMan HIV-1 Test，version 2.0。HIV 定量?jī)x器：Cobas? AmpliPrep/ cobas? TaqMan? 核酸定量檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)羅氏）。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，連續(xù)變量資料采用 t 檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 核酸檢測(cè)結(jié)果 2015年核酸檢測(cè)標(biāo)本300 250例，其中初檢陽(yáng)性2 874例，總陽(yáng)性率為0.96%，各月初檢陽(yáng)性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；核酸初檢單陽(yáng)性628例，總陽(yáng)性率為0.21%，各月核酸單陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；鑒別陽(yáng)性數(shù)129例，總陽(yáng)性率為20.58%，其中2例HIV、127例HBV，未發(fā)現(xiàn)HCV陽(yáng)性。各月核酸鑒別陽(yáng)性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各月數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

2 HIV-1 RNA單陽(yáng)性標(biāo)本跟蹤檢測(cè)情況 2例HIV-1 RNA單陽(yáng)性標(biāo)本初檢酶免四代試劑S/CO值分別為0.569和0.489，明顯高于三代試劑的0.031和0.087。2號(hào)HIV-1 RNA單陽(yáng)性獻(xiàn)血者獻(xiàn)血后第11天酶免雙試劑轉(zhuǎn)陽(yáng)，病毒量由初檢的1.36×104copy/ml上升為1.86×104copy/ml。見(jiàn)表2。

3 核酸檢測(cè)與酶免HBV、HCV和HIV檢測(cè)結(jié)果比較 2015年本中心核酸檢測(cè)與酶免HBV、HCV和HIV檢測(cè)均為陽(yáng)性的標(biāo)本共22 042 832例，2 333例HBV ELISA雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本中有78%（1 829/ 2 333）核酸陽(yáng)性；343例HCV ELISA雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本中66%（226/343）核酸陽(yáng)性；92例HIV ELISA雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本中全部為核酸陽(yáng)性。酶免單試劑陽(yáng)性標(biāo)本中有6%（57/901）為核酸陽(yáng)性。酶免雙試劑陽(yáng)性中核酸陽(yáng)性比例大于酶免單試劑陽(yáng)性（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖1。

表1 2015年廣州地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者各月核酸檢測(cè)情況

表2 2份HIV-1 RNA單陽(yáng)性標(biāo)本的跟蹤檢測(cè)情況

表3 2015年ELISA HBV/HCV/HIV單試劑、雙試劑陽(yáng)性與核酸結(jié)果比較

圖1 2015年ELISA HBV/HCV/HIV單試劑、雙試劑陽(yáng)性與核酸檢測(cè)結(jié)果比較

討 論

2015年本中心核酸單陽(yáng)性標(biāo)本中鑒別陽(yáng)性率為20.58%，鑒別陽(yáng)性標(biāo)本中127例HBV、2例HIV，未發(fā)現(xiàn)HCV陽(yáng)性。造成HBV核酸陽(yáng)性、血清學(xué)陰性的原因主要有兩方面：一是獻(xiàn)血者處在ELISA檢測(cè)“窗口期“，二是獻(xiàn)血者存在隱匿性HBV感染（occult hepatits B virus infection，OBI）。OBI是由于病毒變異、感染者自身免疫等因素導(dǎo)致HBsAg的結(jié)構(gòu)改變或合成降低，血清HBsAg陰性，但血清或肝組織中仍可檢出HBV DNA。OBI感染者體內(nèi)HBV DNA往往很低，常低于200 IU/ml[4]。Fang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA+/HBsAg- 獻(xiàn)血者中有90%～95%都是OBI。Vermeulen等[6]也發(fā)現(xiàn)核酸HBV單陽(yáng)性標(biāo)本主要為OBI，其次是“窗口期”感染。

另外，核酸檢測(cè)單陽(yáng)性標(biāo)本中鑒別診斷的陰性率高達(dá)79.42%，這是單人份核酸檢測(cè)中常碰到的問(wèn)題。這部分核酸檢測(cè)單陽(yáng)性標(biāo)本有可能是假陽(yáng)性。Linnen 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA）方法檢測(cè)西尼羅河病毒時(shí)，細(xì)菌、真菌污染以及正常血漿蛋白等因素均可引起非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致結(jié)果假陽(yáng)性。而這些因素在血液篩查時(shí)是否可以引起初檢結(jié)果的假陽(yáng)性還有待進(jìn)一步探討。另一方面，核酸鑒別陰性可能與標(biāo)本病毒載量較低有關(guān)。姚鳳蘭等[8]采用超速離心濃縮提高病毒滴度后，可提高血液核酸檢測(cè)不確定標(biāo)本的陽(yáng)性率。在標(biāo)本病毒量極低時(shí)，有可能正好未能吸取到病毒核酸而導(dǎo)致核酸鑒別假陰性。

對(duì)2例HIV核酸單陽(yáng)性標(biāo)本的初檢酶免S/CO值比較發(fā)現(xiàn)，2例HIV標(biāo)本酶免四代試劑S/CO值明顯高于三代試劑，但不足以達(dá)到灰區(qū)或cut off值水平，這提示ELISA窗口期時(shí)P24抗原已經(jīng)有微量表達(dá)，因此對(duì)HIV第四代試劑有S/CO偏高的陰性標(biāo)本應(yīng)加以重視。HIV酶免四代試劑增加了P24抗原的檢測(cè)，比第三代試劑更為敏感，可將HIV檢測(cè)“窗口期”平均縮短4～5 d[9]。我們對(duì)2號(hào)HIV核酸單陽(yáng)性獻(xiàn)血者成功的進(jìn)行了跟蹤隨訪，其獻(xiàn)血后第11天酶免雙試劑轉(zhuǎn)陽(yáng)，HIV病毒量由初檢的1.36×104copy/ml上升為1.86×104copy/ml。將隨訪標(biāo)本送廣州市疾病預(yù)防控制中心用免疫印跡法（Western blot，WB）進(jìn)行抗體確證試驗(yàn)，結(jié)論為HIV抗體不確定，帶型為gp120。后經(jīng)隨訪其第28天抗體確證試驗(yàn)為陽(yáng)性，證實(shí)此獻(xiàn)血者獻(xiàn)血時(shí)處在HIV ELISA檢測(cè)“窗口期”。

核酸檢測(cè)靈敏度高，直接檢測(cè)血清中的病原體，能夠從ELISA陰性標(biāo)本中檢出ELISA “窗口期”和隱匿性感染者[3]。但是，我們發(fā)現(xiàn)有504份HBsAg ELISA雙試劑陽(yáng)性、117份HCV ELISA雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本的核酸檢測(cè)為陰性。核酸檢測(cè)漏檢的主要原因是部分獻(xiàn)血者血液中病毒載量低于核酸檢測(cè)的檢測(cè)下限，而抗原抗體水平較高。因此，核酸檢測(cè)不能完全替代常規(guī)的ELISA檢測(cè)，這是由于部分獻(xiàn)血者血液中抗原抗體水平較高，但是病毒載量極低，這也是核酸檢測(cè)漏檢的主要原因[10，11]。ELISA可以檢測(cè)出低病毒量的血清學(xué)陽(yáng)性感染者，兩者在降低輸血相關(guān)病毒感染風(fēng)險(xiǎn)發(fā)揮重要的互補(bǔ)作用。2012版《血站技術(shù)操作規(guī)程》提出：血站可以采用1種ELISA試劑檢測(cè)抗原（抗體），同時(shí)采用1種試劑檢測(cè)核酸的血液篩查模式。如果采用一遍ELISA加一遍核酸檢測(cè)，部分核酸陰性、ELISA單試劑陽(yáng)性標(biāo)本將會(huì)被漏檢，這一部分血液的安全性還有待進(jìn)一步探討。

總之，核酸檢測(cè)能更進(jìn)一步地縮短輸血傳播疾病的檢測(cè)“窗口期”，發(fā)現(xiàn)隱匿性病毒感染，核酸和酶免檢測(cè)在降低輸血相關(guān)病毒感染風(fēng)險(xiǎn)中發(fā)揮著重要的互補(bǔ)作用。

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Analyses of Laboratory Detections with PCR and ELISA in Blood Donors of Guangzhou in 2015

LIN Shi-ya，WANG Hao，LI Zhong-ping，et al.
Blood Center of Guangzhou, Guangdong Province 510095

Objective To analyze the results of nucleic acid tests（NATs） and ELISA detections and explore the correlation of them in reducing the risk of transfusion related infections. Methods Using two kinds of ELISA reagents and ID nucleic acid detection （ID-NAT） for parallel blood screening in blood donation to detect serological markers of HBV, HCV and HIV-1 and virus nucleic acids. Samples were taken from blood bags for further identification when primary test was positive. HIV-1 RNA positive ELISA negative blood donors were followed up. Results In total of 300 250 cases, 0.96% （2 874/300 250） positive cases were detected in the center in 2015.The nucleic acid single positive rate was 0.21%（628/300 250）; the identification positive rate was 20.58% （129/628）. 127 HBVand 2 HIV cases were found and no HCV was seen. Enzyme immunoassay of HBV, HCV and HIV and nucleic acid detection results discovered 2 204 positive cases . 78%（1 829/2 333） HBV ELISA double reagent positive specimens were NAT positive, and 22%（504/2 333） were NAT negative; 66%（226/343） HCV ELISA double reagent positive specimens were NAT positive, and 34%（117/343） were NAT negative; 92 cases of HIV ELISA double reagent positive samples were all NAT positive. Six percent（57/901）ELISA single reagent positive were NAT positive, and 94%（844/901）were NAT negative. The percentage of positive nucleic acid in ELISA double reagent positive was higher than single reagent positive ELISA（P＜0.05）. Conclusion NAT helps shorten "window period" of transfusion transmitted diseases and detect latent infection. Both NAT and ELISA play an important complementary role in reducing the risk of blood transfusion associated virus infection.

Nucleic acid amplification detection OBI Window period Voluntary blood donation

R392.11 R193.2

A

1671-2587（2017）02-0137-05

2016-10-27）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.013

510095 廣東省廣州血液中心

林詩(shī)雅（1985–），女，廣東廣州人，檢驗(yàn)師，學(xué)士，主要從事血液檢驗(yàn)工作，（E-mail）845884359@ qq.com。

鄭優(yōu)榮，男，主任技師，碩士，（Tel）13826036601。