王游游，蔣繼志，李穎，張亞輝，孫涵，郎亞峰

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.保定學院 生化系，河北 保定 071000)

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6株拮抗細菌對致病疫霉抑制作用的比較

王游游1，蔣繼志1，李穎1，張亞輝1，孫涵2，郎亞峰2

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.保定學院 生化系，河北 保定 071000)

比較在前期獲得的明顯抑制致病疫霉菌絲生長的6株細菌的抑菌性能及其防病潛力，為開發(fā)生防制劑防治馬鈴薯晚疫病提供依據(jù).采用對峙培養(yǎng)法和打孔法測定6株細菌活體、菌液和無菌體發(fā)酵液對病菌菌絲生長的抑制作用，利用塊莖切片法評價拮抗菌菌液對晚疫病的離體防治效果.結果表明，6株菌的菌液對菌絲生長的抑制作用均明顯優(yōu)于活體和無菌體發(fā)酵液，抑菌帶寬度均在27mm以上，且均可引起菌絲體畸變，其中以WL2菌株的抑菌作用最強，活體、菌液和發(fā)酵液的抑菌帶寬均在26mm以上，致畸作用也最強；此外，6株菌的菌液在離體塊莖切片上的防病效果也以WL2菌液處理最好，病情指數(shù)最低(13.7)，相對保護率最高(80.5%).這表明菌株WL2比其他5個菌株在防治馬鈴薯晚疫病方面有更大應用潛力.

拮抗細菌；致病疫霉；抑制；離體防病

馬鈴薯是全球僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物，其種植面積和產(chǎn)量逐年增加[1].尤其是2015年中國提出了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，至2020年約有50%的馬鈴薯將作為主糧消費[2].然而，馬鈴薯生產(chǎn)過程中常遭受許多病原菌的危害，其中由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是影響馬鈴薯生產(chǎn)最重要的病害[3].目前，控制晚疫病主要通過抗病品種和噴施化學農(nóng)藥2種方式，但因致病疫霉變異迅速，生理小種越來越復雜[4]，已經(jīng)出現(xiàn)能克服當前生產(chǎn)中現(xiàn)有R1—R11全部抗晚疫病單基因的超級生理小種(1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11)[5].同時，致病疫霉對化學農(nóng)藥的抗性越來越強，加之，化學農(nóng)藥對食品安全和生態(tài)環(huán)境造成巨大威脅[6]，這給馬鈴薯晚疫病的有效防治帶來了巨大的挑戰(zhàn).近年來，探索利用細菌[7]、放線菌[8]、真菌[9]或其代謝產(chǎn)物拮抗致病疫霉菌絲體生長，抑制致病疫霉孢子囊萌發(fā)及釋放游動孢子等無性生殖過程，控制馬鈴薯晚疫病的發(fā)生，得到了許多學者的廣泛關注[7]，并獲得了一定成效[10].本研究室在前期研究中也篩選到了多株對致病疫霉有明顯抑制作用并在離體組織實驗中有突出防病效果的菌株，其中J-28[11](巨大芽孢桿菌)、Sy11[12](細黃鏈霉菌)等菌株對致病疫霉菌絲生長、孢子囊釋放游動孢子和靜止孢子萌發(fā)的抑制率達到80%以上，在離體馬鈴薯葉片和塊莖切片上的保護率均能達到70%以上.本實驗擬對前期篩選獲得的對致病疫霉菌絲生長有強烈抑制作用的WL1和WL2等6株細菌的抑菌特性和離體組織防病效果進行比較，為明確其防病潛力以及開發(fā)生防制劑防治馬鈴薯晚疫病提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株和材料

1.2 拮抗菌活體、菌液和無菌體發(fā)酵液的制備

參考郭會婧等[13]的方法分別制備6株細菌的菌液和無菌體發(fā)酵液.

1.3 拮抗菌活體、菌液和無菌體發(fā)酵液的抑菌活性測定

采用平板對峙培養(yǎng)法[13]測試拮抗細菌活體對致病疫霉的抑制活性，打取經(jīng)黑麥培養(yǎng)基(RYE)活化培養(yǎng)的致病疫霉菌餅(直徑9mm)轉接于新鮮RYE平板中央，在菌餅兩側相距30mm處分別點接一環(huán)經(jīng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB)活化后的待測拮抗菌，以點接等體積的LB培養(yǎng)基為對照，20 ℃暗培養(yǎng)8d后統(tǒng)計抑菌帶寬度(mm).以打孔法[14]分別測定菌液和發(fā)酵液的抑菌作用，在致病疫霉菌餅兩側相距約30mm處打孔(直徑9mm)，加入經(jīng)LB培養(yǎng)的100μL菌液或發(fā)酵液，以等體積LB為對照，20 ℃暗培養(yǎng)8d后統(tǒng)計抑菌帶寬度(mm).

1.4 拮抗菌菌液對致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響

挑取對峙培養(yǎng)過程中受拮抗菌菌液抑制的致病疫霉菌落邊緣的菌絲和對照菌落邊緣的菌絲，在10×40倍顯微鏡視野下每次觀察30個視野，記錄菌絲形態(tài)變化，統(tǒng)計菌絲總畸變率.

菌絲總畸變率=畸變菌絲(段)數(shù)總菌絲(段)數(shù)×100%.

1.5 受拮抗菌菌液抑制后的菌絲體恢復生長能力的測定

參照馮麗娜等[15]的方法從受拮抗菌菌液強烈抑制的致病疫霉菌落邊緣挑取部分菌絲體(瓊脂塊)轉接到新鮮的RYE平板上繼續(xù)培養(yǎng)，以挑取未受抑制的致病疫霉菌絲體為對照，20 ℃黑暗培養(yǎng)8d后十字交叉法測量記錄菌落直徑(mm)，并計算菌絲平均生長速度(mm/d).

有這樣一個教學案例，說的是一位名師執(zhí)教《鷸蚌相爭》時，突然一位學生質疑：“鷸與蚌你一言我一語在斗嘴說話，蚌說話就要張嘴，一張嘴鷸不就脫身了嗎？鷸的喙被蚌夾著，它又怎么說話？”

1.6 6株拮抗菌菌液在離體塊莖上的防病效果

參照蔣繼志等[14]的方法制備馬鈴薯塊莖切片(2.0cm×2.0cm×0.5cm)，分別取50μL的6株拮抗菌菌液均勻涂抹在切片表面上，以等體積LB為對照，20 ℃黑暗保濕培養(yǎng)24h后，在涂抹菌液的切片表面接種致病疫霉菌餅(直徑9mm)，20 ℃黑暗保濕培養(yǎng)7d，觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計病情指數(shù)及塊莖保護率[16].

以上實驗每處理設3～4次重復，實驗重復3次.

2 結果與分析

2.1 拮抗菌活體、菌液和無菌體發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用

由圖1和表1可以看出，供試6株細菌的活體對致病疫霉菌絲生長均有很強的抑制作用，均與對照達到顯著差異(P<0.05)，部分菌株的抑菌效果甚至達到極顯著差異(P<0.01).其中WL2菌株的抑菌作用最強，抑菌帶寬度為28.3 mm，其次是WL1和M15，抑菌帶寬度分別為28.1和27.2 mm，與這3株細菌對峙培養(yǎng)的致病疫霉菌絲幾乎完全不能生長；6株細菌中WR1菌株的抑菌作用最弱，但抑菌帶寬度也達到了18.9 mm.

a.活體；b.菌液；c.發(fā)酵液.圖1 6株拮抗菌對致病疫霉菌絲生長的抑制作用Fig.1 Inhibition of six antagonistic strains on mycelial growth of Phytophthora infestans

經(jīng)一定條件培養(yǎng)所得6株細菌的菌液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用比其活體菌株更強(圖1，表1)，抑菌帶寬度均在27.0 mm以上，抑菌帶最寬達到28.6 mm(WL2菌株)；除WL1菌株外，其余5個菌株的菌液幾乎完全抑制了病菌的生長.6個菌株之間無顯著差異(P<0.05)，但與對照之間均有顯著差異(P<0.05).

供試6株細菌的無菌體發(fā)酵液對致病疫霉菌絲生長的抑制作用有很大差異(圖1，表1).其中，WL2抑菌效果最好，抑菌帶寬為26.1 mm，幾乎能完全抑制致病疫霉菌絲的生長；其次是M15菌株，抑菌帶寬度為22.4 mm，RYE平板上只見少許羸弱的菌絲層；而WR1和WR2的抑菌效果最弱，抑菌帶寬僅分別為6.0 mm和5.2 mm，致病疫霉菌絲層占據(jù)了平板80%以上的面積.

表1 6株拮抗菌對致病疫霉菌絲生長的抑制作用

小寫字母、大寫字母分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著，同列不同字母表示存在顯著性差異，下同.

2.2 拮抗菌菌液對致病疫霉菌體形態(tài)影響的比較

在10×40倍顯微鏡視野下觀察發(fā)現(xiàn)，正常致病疫霉菌絲筆直光滑、粗細均勻、內(nèi)含物分布均勻，孢子囊數(shù)量較多(20～40個/視野)，且內(nèi)部充盈，并呈現(xiàn)典型的檸檬形(圖2a).但受拮抗菌菌液抑制后，一方面菌絲體呈現(xiàn)不同類型的畸變：菌絲局部膨脹(圖2b)、內(nèi)含物分布不均勻(圖2c)、菌絲直角彎曲(圖2d)、粗細不均一(圖2e)、菌絲分枝增多(圖2f)、近分枝處內(nèi)含物外泄(圖2g)、菌絲頂端內(nèi)含物外泄(圖2h)等，另一方面孢子囊數(shù)量大幅減少(0～5個/視野，圖2i)、孢子囊內(nèi)含物外泄(圖2j).總體上供試6株細菌菌液均能導致致病疫霉菌絲局部膨脹、分枝增多和孢子囊數(shù)量銳減.此外，不同細菌菌液對致病疫霉菌體形態(tài)的致畸類型也不盡相同(表2)，WL2菌液可造成8種致畸類型，菌絲總畸變率最高(38.7%)，與其余5株菌達到顯著差異(P<0.05)，其中菌絲直角彎曲和孢子囊內(nèi)含物外泄在其他幾種處理中均未觀察到；其次是WL1菌液，可造成6種致畸類型，菌絲總畸變率為31.2%；而WR2菌液的致畸類型最少，僅有4種，菌絲總畸變率也最低(16.6%).

a.正常菌絲；b.菌絲局部膨脹；c.菌絲內(nèi)含物分布不均勻；d.菌絲直角彎曲；e.菌絲粗細不均一；f.菌絲分枝增多；g.菌絲近分枝處內(nèi)含物外泄；h.菌絲頂端內(nèi)含物外泄；i.孢子囊數(shù)量銳減；j.孢子囊內(nèi)含物外泄.圖2 6株拮抗菌菌液對致病疫霉菌體形態(tài)的影響Fig.2 Effect of six antagonistic bacterial liquid on Phytophthora infestans mycelial morphology

菌株畸變類型菌絲局部膨脹菌絲內(nèi)含物分布不均勻菌絲直角彎曲菌絲粗細不均一菌絲分枝增多近分枝處內(nèi)含物外泄菌絲頂端內(nèi)含物外泄孢子囊數(shù)量銳減孢子囊內(nèi)含物外泄菌絲畸變類型數(shù)/種菌絲總畸變率/%WL2++++++++838.7aWL1++++++631.2bM15++++++629.9bWR1+++++521.6cWK1+++++523.1bcWR2++++416.6d

2.3 拮抗菌菌液對致病疫霉菌絲的作用方式以及受抑制后菌絲恢復生長能力測定

供試6株細菌的菌液均可強烈抑制甚至完全阻止致病疫霉菌絲生長，但將受到抑制的菌絲體轉接至新鮮RYE平板上后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，菌絲均能緩慢恢復生長(圖3，圖4)，說明這幾株拮抗菌對致病疫霉菌絲的作用方式只是抑制其生長，而非殺死菌絲.但菌絲恢復生長的速度卻因拮抗細菌菌株不同而有很大差異，除WR2菌液外其余5株細菌的處理均與對照有顯著差異(P<0.05).其中受WL2菌液抑制的致病疫霉菌絲恢復生長的速度最慢(2.5 mm/d)，轉接至新鮮RYE平板上之后第8 d，也僅在菌餅周圍有少許菌絲出現(xiàn)，說明WL2菌液對致病疫霉菌絲造成了極強的傷害，導致菌絲幾乎不能恢復生長；其次是WL1和M15菌液，菌絲體恢復生長速度分別為4.8 mm/d和5.3 mm/d，但菌絲比較稀疏；而受WR2菌液抑制的致病疫霉菌絲恢復生長的速度最快，大約10.3 mm/d，雖然菌絲生長速度與對照(10.9 mm/d)無顯著性差異(P<0.05)，但菌絲的茂盛程度顯然不如對照.

圖3 經(jīng)6株拮抗菌菌液抑制后的菌絲恢復生長比較Fig.3 Comparison of recovery growth of Phytophthorainfestans after inhibition with six antagonistic bacterial liquid

圖4 經(jīng)6株拮抗菌菌液抑制后的菌絲恢復生長速度比較Fig.4 Comparison of recovery growth rate of Phytophthora infestans after inhibition with six antagonistic bacterial liquid

2.4 6株拮抗菌菌液在離體塊莖上的防病效果

根據(jù)上述實驗結果，對WL1和WL2等6株拮抗菌菌液在馬鈴薯塊莖切片上的病害預防效果進行了比較(圖5，表3).結果顯示，經(jīng)WL2菌液處理后的塊莖切片防病效果最好，塊莖病情指數(shù)僅為13.7，相對保護率高達80.5%，與其余菌株存在顯著差異(P<0.05)，觀察發(fā)現(xiàn)菌餅上的菌絲稀疏，未見擴散生長，塊莖切片表面顏色鮮亮有光澤，未見明顯變色或腐爛現(xiàn)象；其次WL1、M15菌液離體塊莖防病效果較好，菌液處理的塊莖切片病情指數(shù)分別為20.3和22.9，相對保護率分別為71.1%和67.4%，菌餅上的菌絲體主要向菌餅上方生長，并未貼在切片表面蔓延生長，塊莖切片表面顏色稍有褐變，但塊莖硬實沒有出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象；WR1、WR2菌液處理后的塊莖防病效果最差，塊莖切片病情指數(shù)分別為36.1和39.8，相對保護率分別為48.6%和43.4%，但與對照塊莖切片病情指數(shù)70.3相比存在顯著差異(P<0.05)，切片表面顏色深暗出現(xiàn)較嚴重褐變，菌絲沿著切片表面蔓延生長，幾乎覆蓋塊莖表面面積的50%.對照中的切片受到病菌的侵染，切片表面顏色深暗無光澤，且菌絲厚實茂盛，沿著切片表面蔓延生長，菌絲幾乎覆蓋了塊莖的整個表面，并且塊莖已開始出現(xiàn)腐爛變軟現(xiàn)象.

圖5 6株拮抗菌菌液的離體塊莖預防效果Fig.5 Prevention effect of six antagonistic bacterial liquid on in vitro tubers

菌株病情指數(shù)相對保護率/%WL213.780.5aWL120.371.1abM1522.967.4bWK124.065.9bWR136.148.6cWR239.843.4cCK70.30d

3 討論

近年來，利用微生物或其代謝產(chǎn)物作為一種預防植物病害的手段越來越受到人們的重視和青睞[17].通過拮抗菌及其代謝產(chǎn)物抑制致病疫霉、控制馬鈴薯晚疫病的發(fā)生已受到國內(nèi)外眾多學者的關注[18].楊立賓等[19]比較了包括哈茨木霉T-28等6株生防木霉菌株對致病疫霉的抑制效果，結果顯示，哈茨木霉T-28菌株對致病疫霉的抑制效果最好，拮抗等級為I級，該菌發(fā)酵液對菌絲生長的抑制率為64.71%，對孢子囊萌發(fā)的抑制率為64.41%，對孢子囊釋放游動孢子的抑制率也達到了68.31%.Hunziker等[18]通過實驗證明了產(chǎn)氫氰酸假單胞菌分泌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物1-Undecene可有效抑制致病疫霉菌絲生長、孢子囊形成和孢子囊直接萌發(fā)，抑制率均能達到60%以上，且發(fā)現(xiàn)孢子囊直接萌發(fā)與1-Undecene呈劑量依賴關系，隨著1-Undecene物質濃度的增加，孢子囊直接萌發(fā)率顯著下降，當1-Undecene質量濃度為0.75 mg/L時孢子囊直接萌發(fā)率約為10%左右.本實驗室黃英菊等[12]對放線菌Sy11、細菌HT-6和SR13-2抑制致病疫霉菌絲生長的影響進行了比較，并在實驗中觀察了拮抗菌菌液對致病疫霉菌絲形態(tài)的影響，結果表明，3種拮抗菌菌液對致病疫霉菌絲生長的抑制率分別為87.8%、75.8%和71.9%；此外，拮抗菌菌液抑制菌絲生長造成的菌絲畸形因拮抗菌種類不同而有一定區(qū)別，并發(fā)現(xiàn)對致病疫霉拮抗效果最好的Sy11菌株對致病疫霉菌絲造成的致畸種類最多.此外，本實驗室馮麗娜等[15]觀察到內(nèi)生真菌DC-11發(fā)酵液可導致致病疫霉菌絲局部膨大、粗細不勻、原生質外泄等多種形式的畸形，還發(fā)現(xiàn)受抑制的菌絲恢復生長的速度與發(fā)酵液濃度呈劑量依賴關系，當發(fā)酵液濃度達到1.91 mg/mL時可導致菌絲完全死亡.

本實驗進一步比較了前期獲得的6株拮抗菌抑制致病疫霉的部分性能，整體來看，各菌株活體、菌液和無菌體發(fā)酵液對菌絲生長的抑制強度并不總是完全一致，菌液抑制作用幾乎普遍強于活體和發(fā)酵液的抑制作用，各菌株菌液的抑菌帶寬度均能達到27 mm以上.測試菌液對致病疫霉菌體形態(tài)的影響后，發(fā)現(xiàn)6株拮抗菌菌液均能使菌絲產(chǎn)生局部膨脹、分枝增多、孢子囊數(shù)量銳減，并且不同拮抗菌對致病疫霉菌絲體形態(tài)的影響還存在一定區(qū)別，其中抑菌效果最好的WL2菌株可對致病疫霉菌絲造成8種致畸影響，菌絲總畸變率高達38.7%，這一結果與黃英菊等[12]的報道基本一致；通過考查受拮抗菌菌液抑制后菌絲的恢復生長，發(fā)現(xiàn)6株拮抗菌均沒有使菌絲完全死亡，只是對菌絲造成不同程度的傷害，以至于抑制后的菌絲以比正常菌絲更加緩慢的速度恢復生長；其中WL2菌液抑制后的菌絲恢復生長能力最差，恢復生長速度僅為2.5 mm/d.由菌株活體、菌液和無菌體發(fā)酵液3個方面的抑菌作用、菌液對菌絲體形態(tài)的影響以及菌絲恢復生長速度等方面的比較可以看出，WL2菌株顯示出了最強的抑制活性，抑菌帶寬均能達到26 mm以上.此外WL2菌液在離體組織防病方面也顯示出了很好的效果，經(jīng)WL2菌液處理后的馬鈴薯塊莖病情指數(shù)僅為13.7，相對保護率高達80.5%，與其余5株菌存在顯著差異(P<0.05).綜合以上實驗結果，表明WL2菌株在防治馬鈴薯晚疫病方面顯示出了巨大的應用潛力.今后若能進一步優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，深入研究該菌抑菌機理，明確其中的抑菌物質，將有助于加快該菌株在防治馬鈴薯晚疫病方面的利用進程，為利用植物內(nèi)生細菌防治馬鈴薯晚疫病增加一種選擇.

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(責任編輯：趙藏賞)

Inhibition comparison of six antagonistic bacteria againstPhytophthorainfestans

WANG Youyou1,JIANG Jizhi1,LI Ying1,ZHANG Yahui1,SUN Han2,LANG Yafeng2

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China；2.Department of Biochemistry,Baoding University,Baoding 071000,China)

The six bacterial strains including WL1,WL2,WR1,WR2,WK1 and M15,obtained in previously experiments,had the obvious inhibition toPhytophthorainfestansmycelia growth.In order to clarify the biocontrol potential,the inhibition property and the disease prevention effects oninvitrotissue of six strains were compared in this experiment.The dual-culture method and punch method were adopted to determine the inhibition of living bacteria,bacterial liquid,as well as fermented liquid onP.infestansmycelia growth.The potato tuber slices method was used to evaluate the disease prevention effect of bacterial liquid.The results showed that the inhibition effects of six bacterial liquid toP.infestansgrowth were significantly greater than that of living bacteria and fermented liquid,and the inhibitory zones were above 27 mm,and all of them caused mycelial malformation.In which,bacterial liquid of WL2 strain displayed the strongest inhibitory effect,the inhibitory zones were above 26 mm,and caused the most serious malformation.In addition,WL2 bacterial liquid acquired the best disease prevention oninvitrotissue in comparison with other 5 strains,the disease index was only 13.7,and the relative protection ratio was up to 80.5%.These results indicate that WL2 strain has more potential in control potato late blight in the future.

antagonistic bacteria；Phytophthorainfestans；inhibition；disease prevention

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.010

2016-09-20

河北省自然科學基金資助項目(C2015201231)；河北省科技支撐計劃項目(13226502D)；河北大學研究生創(chuàng)新項目(X2016073)

王游游(1992—)，男，河北石家莊人，河北大學在讀碩士研究生.E-mail：15032257263@163.com

蔣繼志(1960—)，男，寧夏中寧人，河北大學教授，博士生導師，主要從事植物病害生物防治研究. E-mail：jizhijiang909@163.com

Q

A

1000-1565(2017)02-0169-07