田 博,金 堅,惠人杰,徐鳳蓮,吳 濤,李 偉

(1.江南大學藥學院，江蘇無錫214122； 2.無錫同昕生物技術(shù)有限公司,江蘇無錫214028)

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獸藥殘留檢測中磺胺嘧啶ELISA試劑盒的研制

田 博1,2,金 堅1,惠人杰1,徐鳳蓮2,吳 濤2,李 偉2

(1.江南大學藥學院，江蘇無錫214122； 2.無錫同昕生物技術(shù)有限公司,江蘇無錫214028)

以合成的耦聯(lián)抗原BSA-磺胺嘧啶和磺胺嘧啶(SD)的單克隆抗體為材料,建立了SD間接競爭ELISA的方法。方法的檢測靈敏度為0.213 ng/mL,線性檢測范圍為1.84～57.41 ng/mL,除與磺胺二甲嘧啶反應(yīng)率超過10%外,與其他磺胺類藥物交叉反應(yīng)率均低于1.5%,4 ℃放置180 d沒有明顯的變化。采用豬尿、牛奶、豬肉3類樣本進行的添加回收實驗,批內(nèi)CV均小與10%，批間CV小于15%，平均添加回收率介于75%～90%。因此，組建的試劑盒可以滿足動物飼養(yǎng)檢測SD的要求。

磺胺嘧啶;間接競爭ELISA;回收實驗;交叉反應(yīng)率

動物性食品中獸藥和飼料添加劑的殘留對環(huán)境和人體健康的危害已成為現(xiàn)在亟待解決的問題之一,其中，磺胺類藥物特別是磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺甲基異惡唑等作為飼料添加劑或動物疫病治療藥物的不合理用藥在動物性食品中的殘留已受到國際社會的普遍關(guān)注[1-2]。我國以及美國、歐盟等國家規(guī)定了動物性食品中磺胺嘧啶的最高殘留限量為0.1 mg/kg。目前，檢測磺胺嘧啶殘留的常用方法主要是高效液相色譜法(HPLC)[3]和酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)[4-5],后者作為磺胺嘧啶殘留檢測方法，具有適用于臨床使用方便的優(yōu)勢。ELISA是一種應(yīng)用比較成熟的超微量定量分析方法，不僅通量適可、簡便易行而且經(jīng)濟，目前所用裝備均已可以國產(chǎn)化生產(chǎn)，能夠適于基層單位普及應(yīng)用。由于動物性食品中磺胺嘧啶殘留分析樣品具有一定的特殊性，而已有相應(yīng)ELISA對樣品分析的適用度尚有許多局限，因此開發(fā)更具實用價值的磺胺嘧啶ELISA十分必要。

圖1 磺胺嘧啶的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of sulfadiazine

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

包被抗原BSA-SD由同昕生物技術(shù)公司合成；SD單克隆抗體，標準品稀釋液分別購自美國YKD公司、上海譜振生物科技有限公司；42592 Costar 96孔酶標板，上海蔚宏生物科技有限公司；ELISA洗板機，廈門瑞博欣儀器設(shè)備有限公司；LSY-300型酶標儀，深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司；其他化學試劑，市售國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 BSA-SD的合成

采用戊二醛法進行BSA-SD耦聯(lián)抗原的合成，分析并計算BSA與SD的耦聯(lián)比為1∶ 5，可用于實驗過程中酶標板的包被。

1.2.2 包被抗原BSA-SD與SD單克隆抗體工作濃度的確定

以方陣滴定法[6]確定包被抗原BSA-SD與SD單克隆抗體(SD-mAb)的最佳工作濃度。以0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液配置已優(yōu)化的BSA-SD包被濃度，4 ℃過夜包被的96孔酶標板后，用0.01 mol/L、pH 7.4磷酸鹽(PBS)緩沖液洗板3次,每次浸泡2～3 min。去除洗板液，加入含0.1%明膠的抗體稀釋液37 ℃放置2 h封閉后烘干備用。

1.2.3 競爭ELISA方法的建立

用標準品稀釋液溶解SD，定容并逐級稀釋配制SD標準品，最終質(zhì)量濃度分別為81、27、9、3和1 ng/mL。然后按下列操作進行[7]：1)設(shè)置0標準點，按SD標準品溶液梯度加入50 μL/孔。每孔加入50 μL SD-mAb，25 ℃溫育30 min，含0.1%明膠的0.01 mol/L、pH 7.4 PBS緩沖液洗板3次。2)加入1∶ 4 000比例稀釋的酶標羊抗鼠IgG，25 ℃溫育30 min后，洗板5次。3)加入50 μL/孔TMB的磷酸-檸檬酸緩沖液避光顯色15 min，再加入50 μL/孔2 mol/L 稀H2SO4終止反應(yīng)后，酶標儀(450 nm)測定吸光度值OD。

1.2.4 競爭ELISA的參數(shù)優(yōu)化

1)包被條件優(yōu)化[8-9]。分別設(shè)置包被條件為37 ℃、2 h,4 ℃過夜和37 ℃溫育2 h后4 ℃過夜為分析最佳包被條件。

2)包被緩沖液的優(yōu)化。對比3種包被緩沖液:0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4),0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)和NaCl生理鹽水，選擇最佳的包被緩沖液。

3)競爭反應(yīng)時間的優(yōu)化。分別設(shè)置競爭反應(yīng)時間為0.5、1和1.5 h，選擇最優(yōu)的競爭反應(yīng)時間。

4)顯色反應(yīng)時間的優(yōu)化。將顯色時間分別設(shè)置為10、15和20 min，對比所得吸光度值確定最佳的顯色反應(yīng)時間。

1.2.5 空白樣品添加回收實驗

在尿液、牛奶和豬肉中添加不同濃度的SD標準品，通過實驗結(jié)果計算添加回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV)來確定其準確度。尿液(豬尿)樣品用3個不同批次的酶標板分別進行實驗；每個批次均選擇3個標準品濃度進行添加，且每個添加濃度設(shè)置3個平行組；SD標準品添加完成混勻后經(jīng)3 000 r/min離心5 min，取上層1 mL清亮尿液移至10 mL玻璃管中，經(jīng)4倍稀釋用于檢測，SD的終質(zhì)量濃度分別為3、6和15 ng/mL。向牛奶樣本中添加SD標準品，離心10 min后吸除上層脂肪,經(jīng)20倍稀釋用于檢測。豬肉組織樣本勻漿后稱取2 g，添加SD標準品；取50 mL于離心管內(nèi)并加入8 mL乙腈,振蕩器振蕩20 min后3 000 r/min離心5 min；取2 mL上清移至玻璃管中，56 ℃N2吹干；加入正己烷和PBS緩沖液溶解，離心10 min去除上層正己烷相，取下層液相用于檢測。

1.2.6 特異性

通過競爭ELISA方法分別測定SD以及磺胺喹惡啉、磺胺二甲嘧和磺胺異惡唑的IC50,比較交叉反應(yīng)率CR(cross-reactivity,磺胺嘧啶的IC50/其他藥物的IC50× 100%)來判斷方法對于SD檢測的特異性。

1.2.7 穩(wěn)定性

將試劑盒于4 ℃環(huán)境條件下放置0、30、90和180 d后，分析標準曲線的漂移,比較檢測牛奶樣品的數(shù)據(jù)變異系數(shù)(CV)的大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 包被抗原BSA-SD與抗體SD-mAb工作濃度的確定

對實驗數(shù)據(jù)進行系列對比,結(jié)合實驗原料經(jīng)濟性等因素，確定競爭ELISA反應(yīng)實驗的抗原包被質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL,抗體最佳工作濃度為1∶ 10 000。

2.2 競爭ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過實驗數(shù)據(jù)對比,確定優(yōu)化后的反應(yīng)條件為包被條件采用4 ℃過夜方式；包被緩沖液選擇0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)；最佳競爭反應(yīng)時間為0.5 h；顯色反應(yīng)時間為15 min。

2.3 競爭反應(yīng)條件優(yōu)化后的ELISA標準曲線

圖2 優(yōu)化后的競爭ELISA標準曲線Fig.2 Standard curve of competitive ELISA after optimization

2.4 準確度(添加回收實驗)

考察磺胺嘧啶在豬尿液、牛奶和豬肉中添加回收實驗，結(jié)果見表1。由表1可知：豬尿樣品的添加回收率在75.7%～84.8%，批內(nèi)變異系數(shù)CV 為1.9%～8.3%，批間變異系數(shù)CV 2.5%～9.7%。牛奶樣品的添加回收率為81.5%～89.7%，變異系數(shù)CV 為2.8%～8.6%。豬肉樣品添加回收率為74.4%～82.3%，變異系數(shù)CV為3.7%～8.1%。

表1 針對不同樣本的SD添加回收實驗

2.5 特異性實驗

通過競爭ELISA方法測定磺胺嘧啶與磺胺喹惡啉、磺胺二甲嘧和磺胺異惡唑的IC50及交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表2。由表2可知：該ELISA試劑盒除與磺胺二甲嘧啶有一定的交叉反應(yīng)之外，與磺胺喹惡啉、磺胺異惡啉和磺胺吡啶的交叉反應(yīng)率均低于1.5%。

表2 交叉反應(yīng)率的測定

2.6 穩(wěn)定性實驗

為了確定試驗盒的穩(wěn)定性，將試劑盒在4 ℃條件下，放置0、30、90和180 d后測定SD的回收率和CV值，結(jié)果見表3。由表3可知：實驗期間不同時間牛奶樣品添加回收試驗的綜合回收率差異不顯著，批內(nèi)變異系數(shù)CV均未超過10%。

表3 保存試劑盒一段時間后的SD添加回收實驗

3 結(jié)論

本研究建立SD的ELISA方法，其檢測靈敏度、特異性、檢測范圍、精密度、準確度和穩(wěn)定性不僅可以滿足食品原料和成品中SD含量的檢測，還能滿足目前國家對SD限量要求的分析，且SD ELISA批內(nèi)變異系數(shù)小于10%，批間小于15%都可以滿足國家對SD限量要求的分析?；前奉愃幬锞哂械膶Π被交酋０方Y(jié)構(gòu)特征，導致SD ELISA與其他磺胺類藥物有一定的交叉反應(yīng)率，但本實驗的研究結(jié)果大多屬于可以接受的范圍，因此對國家限量檢測磺胺類藥物無明顯的影響，測定方法的穩(wěn)定性可以滿足試劑盒的要求。尤其重要的是，本研究通過對常見食品添加回收的數(shù)據(jù)分析顯示建立的SD ELISA對樣品分析的適用度寬，可以滿足HPLC樣品的篩選和現(xiàn)場檢查的要求。

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(責任編輯 周曉薇)

Determination of sulfadiazine in the veterinary drugs residue by sensitive ELISA

TIAN Bo1,2,JIN Jian1,HUI Renjie1,XU Fenglian2,WU Tao2,LI Wei2

(1. School of Pharmaceutical Sciences,Jiangnan University,Wuxi 214122，China; 2. Wuxi Tongxin Biotechnology Co. Ltd.,Wuxi 214028，China)

Using indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),a rapid,highly selective and extremely sensitive method has been established for the determination of sulfadiazine (SD).The SD detection limit was 0.213 ng/mL for indirect competitive ELISA formats,the assay ranges from 1.84 to 57.41 ng/mL,except for the cross reactivity with sulfadimidine is over 10%, cross reaction with other sulfadrugs were low than 1.5%, and there was no significant change under 4 ℃ in 180 d.The within-run and between-run CVs of the SD-ELISA were less than 10% and 15%,respectively.The mean recoveries from the SD-free pig urine,milk and pork were 75% to 90%.The results show that the SD-ELISA method can be applied to detect the SD contamination in food and animal feed.

sulfadiazine; indirect competitve ELISA; recovery test; cross-reaction rate

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.011

2014-03-13

江蘇省自然科學基金青年項目(BK20140136)

田 博(1987—)，男，吉林農(nóng)安人，研究方向：藥物分析;金 堅(聯(lián)系人)，教授，E-mail：jianjin@jiangnan.edu.cn

TS201

A

1672-3678(2017)01-0069-04