閆同順，楊金艷，王 方，祝加男

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東臨沂276006；2.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂276000)

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響應(yīng)面法優(yōu)化毒三素鏈霉菌中利普司他汀的提取工藝

閆同順1，楊金艷2，王 方1，祝加男1

(1.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東臨沂276006；2.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂276000)

采用響應(yīng)面法對毒三素鏈霉菌提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先確立乙醇為最佳的溶劑。以利普司他汀提取收率為指標(biāo)，以乙醇為浸提溶劑，對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時間、浸提溫度和浸提次數(shù)進(jìn)行單因素實驗。在此基礎(chǔ)上，選取料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提時間為自變量，采用Box-Behnken設(shè)計的方法，研究各自變量及其交互作用對利普司他汀提取收率的影響。結(jié)果表明：毒三素鏈霉菌中利普司他汀的最佳提取工藝條件為液料比6.32∶ 1 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、浸提時間3.61 h。在此條件下，利普司他汀提取收率的預(yù)測值為83.35%，實驗驗證值為84.50%，相對誤差為1.36%。

毒三素鏈霉菌；利普司他??；提??；單因素優(yōu)化；響應(yīng)面分析

進(jìn)入21世紀(jì)，由于人們物質(zhì)生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的不合理，肥胖癥呈現(xiàn)年輕化和普遍化態(tài)勢，嚴(yán)重影響人們的生活和健康。奧利司他(orlistat)商品名為賽尼可(Xenical)，是瑞士Hoffmann-La Roche公司研發(fā)的一種非全身作用的、具有良好耐受性和有效性的新型減肥藥物[1]，能減少體內(nèi)1/3脂肪的水解和吸收[2]，是目前世界減肥流行的一個全新選擇。

化學(xué)方法全合成奧利司他無成本優(yōu)勢，目前主要方法是將發(fā)酵法生產(chǎn)的利普司他汀氫化制備奧利司他[3]。利普司他汀作為一種脂肪酶抑制劑，最早在20世紀(jì)80年代由羅氏公司于1株毒三素鏈霉菌的變異株發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)[4-5]。經(jīng)過對利普司他汀產(chǎn)生菌的誘變育種、高產(chǎn)菌株篩選和發(fā)酵工藝的研究[6-8]，利普司他汀的發(fā)酵單位由當(dāng)初的不足2 g/L提高至7 g/L以上的水平[9-10]。利普司他汀屬于胞內(nèi)產(chǎn)物[11]，難溶于水，通過發(fā)酵液固液分離，得到含利普司他汀的菌絲體。然后，選擇一種有機(jī)溶劑對菌體進(jìn)行破壁提取，對影響提取收率的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，這直接關(guān)系到下游產(chǎn)品的質(zhì)量和整條工藝的總收率，有關(guān)這方面的研究報道較少。李玲等[11]利用甲醇超聲破碎菌絲體，通過大孔樹脂分離純化利普司他汀，但甲醇收率低、毒性高。胡衛(wèi)民等[12]和安鴻等[13]采用丙酮萃取與超聲破碎菌體細(xì)胞的提取工藝，雖然收率高于甲醇，但所得產(chǎn)品純度低、色素重，不利于后續(xù)工藝的繼續(xù)純化。

本文中，筆者在單因素實驗[14]的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法[15-17]，通過對乙醇浸提菌體時的不同影響因素進(jìn)行優(yōu)化研究，以確定最佳的提取工藝條件，為該工藝應(yīng)用提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

菌體的獲得：毒三素鏈霉菌發(fā)酵液由筆者所在發(fā)酵工程實驗室(生工五室)發(fā)酵而得，向發(fā)酵液中加入濃鹽酸調(diào)pH 3～4，加入發(fā)酵液體積8%的珍珠巖助濾劑，過濾得含利普司他汀的菌體；利普司他汀對照品(色譜純度90%)，實驗室自制；甲醇、丙酮、乙醇(分析純)，西隴化工股份有限公司；乙腈(色譜純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Agilent 1100型 高效液相色譜儀，Agilent Technologies；SHB-B88 型水循環(huán)真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；100 mm布氏漏斗、500 mL抽濾瓶，蜀牛玻璃儀器有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司；JY92-Ⅱ D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體浸提方法及溶劑的確定

取15 g菌體，置于250 mL三角瓶中，按照質(zhì)量體積比(g/mL)1∶ 5的比例分別向其中加入甲醇、丙酮和乙醇，每種溶劑重復(fù)處理3次。密封后，放入搖床，于200 r/min振搖2 h，布氏漏斗過濾，得利普司他汀浸提濾液。

1.2.2 利普司他汀的分析方法

將溶劑浸提所得利普司他汀濾液用乙腈稀釋10倍，過0.22 μm濾膜后，直接進(jìn)樣。色譜條件：色譜柱 C-18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相V(乙腈)∶V(85%磷酸)∶V(水)=860∶ 0.05∶ 140；檢測波長210 nm；進(jìn)樣量5 μL；流速1.5 mL/min；柱溫30 ℃。

1.2.3 利普司他汀提取收率的計算

取1 g菌體，置于25 mL的容量瓶中，加入20 mL丙酮，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)100 W、30 ℃超聲30 min，再次加入丙酮定容，取樣，過0.22 μm有機(jī)濾膜，進(jìn)樣作高效液相色譜(HPLC)分析，按外標(biāo)法依據(jù)對照品標(biāo)線計算利普司他汀濃度，從而得出1 g菌餅中利普司他汀的含量，將其記為A，則待測菌餅質(zhì)量X克時，計算出的利普司他汀濃度為B，濾液體積為V時，按式(1)計算提取收率。

提取收率=[(BV)/(XA)]×100%

(1)

1.2.4 單因素實驗

以乙醇為浸提溶劑，分別考察溫度、液料比、溶劑濃度、浸提時間和浸提次數(shù)等因素對利普司他汀提取收率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法實驗

響應(yīng)面分析法是利用合理的設(shè)計并通過實驗得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次逐步回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程分析尋找最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[18]。結(jié)合單因素影響實驗結(jié)果，采用Box-Behnken實驗設(shè)計，選取液料比X1、乙醇體積分?jǐn)?shù)X2、浸提時間X33個主要影響因素，在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，以-1、0、+1代表變量的水平，按方程xi=(Xi-X0)/ΔX對自變量進(jìn)行編碼，式中：xi為變量的編碼值，Xi為變量的真實值，X0為實驗中心點變量的真實值，ΔX為變量的變化步長，利普司他汀提取收率Y為響應(yīng)值。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提溶劑的選擇

甲醇、乙醇和丙酮3種溶劑對菌體進(jìn)行浸提處理，得到利普司他汀的浸提收率分別為86%、83%和88%，利普司他汀的純度分別為88%、90%和85%。盡管丙酮浸提收率高，但純度低，可能是丙酮破壞菌體細(xì)胞壁，提取產(chǎn)品的同時，也浸提出了更多的雜質(zhì)。從溶劑毒性大小、產(chǎn)品質(zhì)量和環(huán)境兼容性角度考慮，選擇乙醇浸提菌體，作為實驗溶劑進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 單因素實驗結(jié)果及分析

2.2.1 溫度對利普司他汀提取收率的影響

在固定液料比3∶ 1 (mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、浸提時間2 h、提取次數(shù)1次的條件下，考察溫度對利普司他汀提取收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 浸提溫度對利普司他汀提取收率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of lipstatin

由圖1可知：在實驗溫度范圍內(nèi)，利普司他汀的提取收率變化不大，在15～25 ℃時，利普司他汀的提取收率逐步增加，但隨著溫度由25 ℃升至55 ℃，利普司他汀提取收率呈緩慢的下降趨勢。這是因為利普司他汀屬于內(nèi)酯類化合物，溫度升高，加劇了產(chǎn)品的水解反應(yīng)，使利普司他汀濃度減小。因此，25 ℃為利普司他汀的最佳提取溫度。

2.2.2 液料比對利普司他汀提取收率的影響

在固定溫度25 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、浸提時間2 h、提取次數(shù)1次條件下，考察液料比對利普司他汀提取收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對利普司他汀提取收率的影響Fig.2 Effect of solvent/material ratio on extraction rate of lipstatin

由圖2可知：液料比的增加，有利于利普司他汀提取收率的增加，當(dāng)液料比增加至6∶ 1 mL/g時，提取收率已接近最大值；再繼續(xù)增加料液比，利普司他汀提取收率略為降低，這可能是因為增加乙醇體積的同時，體系中的水量也增多，致使產(chǎn)品水解。因此，從成本角度及后續(xù)工藝處理的要求考慮，選擇6∶ 1 mL/g為最佳的液料比。

2.2.3 浸提時間對利普司他汀提取收率的影響

在固定液料比6∶ 1 mL/g、溫度25 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取次數(shù)1次的條件下，考察浸提時間對利普司他汀提取收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 浸提時間對利普司他汀提取收率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of lipstatin

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對利普司他汀提取收率的影響

在固定液料比6∶ 1 mL/g、溫度25 ℃、浸提時間4 h、提取次數(shù)1次的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對利普司他汀提取收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對利普司他汀提取收率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentraion on extraction rate of lipstatin

由圖4可知：乙醇體積分?jǐn)?shù)對利普司他汀提取收率影響十分顯著。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，利普司他汀提取收率迅速增加，至乙醇體積分?jǐn)?shù)95%時，利普司他汀提取收率達(dá)84%，再增加乙醇體積分?jǐn)?shù)至99%，利普司他汀提取收率為83.8%。從成本角度考慮，選擇95%的乙醇為最佳浸提濃度。

2.2.5 浸提次數(shù)對利普司他汀提取收率的影響

在固定液料比6∶ 1 mL/g、溫度25 ℃、浸提時間4 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)95%的條件下，考察浸提次數(shù)對利普司他汀提取收率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 浸提次數(shù)對利普司他汀提取收率的影響Fig.5 Effect of extraction number on extraction rate of lipstatin

由圖5可知：乙醇浸提1次，利普司他汀提取收率達(dá)到84.5%，乙醇浸提2次，利普司他汀提取收率可達(dá)90%，再增加浸提次數(shù)，利普司他汀提取收率變化不明顯。從簡化工藝、節(jié)約溶劑用量角度考慮，選擇乙醇浸提1次菌體，比較有利于利普司他汀后續(xù)的分離純化和質(zhì)量保證。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化的實驗結(jié)果

選擇對提取收率影響較為明顯的3個因素：液料比(x1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(x2)、浸提時間(x3)為主要考察因素，每個因素選3個水平，以提取收率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken實驗設(shè)計，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到利普司他汀提取收率(Y)對液料比(x1)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(x2)、提取時間(x3)的二次多項回歸模型為

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。從表3可以看出：F值=36.21，P<0.000 1，表明模型高度顯著。3個因素的顯著性排序(從大到小)為浸提時間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)。該模型的調(diào)整確定系數(shù)R2= 0.957 7，說明模型能夠解釋95.77%的響應(yīng)值變化。因此，模型擬合程度良好，可以用此模型對毒三素鏈霉菌中利普司他汀的提取收率進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析

注：**表示極顯著水平(p<0.01)；*表示顯著水平(p<0.05)。

2.3.3 利普司他汀提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

圖6～8是響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果3D圖。由圖6可知：隨著液料比(X1)的不斷加大和乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2)的不斷提高，利普司他汀提取收率逐步增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)最高點之后，再增加液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取收率變化趨于平穩(wěn)。由圖7浸提時間(X3)曲面斜率大于液料比(X1)曲面斜率可知，浸提時間對利普司他汀提取收率的影響大于液料比對提取收率的影響。由圖8可見：利普司他汀提取收率的大小受到浸提時間(X3)和乙醇體積分?jǐn)?shù)(X2)的共同影響。隨著浸提時間的延長，提取收率先增加，后減少。而隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，提取收率迅速增加，之后變化很小。

圖6 提取收率與X1和X2的關(guān)系Fig.6 Effects of X1 and X2 on extraction rate of lipstatin

圖7 提取收率與X1和X3的關(guān)系Fig.7 Effects of X1and X3 on extraction rate of lipstatin

圖8 提取收率與X2和X3的關(guān)系Fig.8 Effects of X2 and X3 on extraction rate of lipstatin

通過對回歸模型求解，得出利普司他汀浸提收率最大值83.35%，此時x1=0.32、x2=0.76、x3=-0.39，液料比為6.32∶ 1 (mL/g)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%、浸提時間為3.61 h。

2.3.4 驗證試驗

在最優(yōu)條件下進(jìn)行試驗驗證，利普司他汀提取收率的平均值為83.35%，回歸方程所得的利普司他汀提取收率的預(yù)測值為84.5%，相對誤差為1.36%，說明回歸方程能較好地反映各因素對提取收率的影響，證明應(yīng)用響應(yīng)面法在利普司他汀提取收率中所建的回歸模型較可靠。

3 結(jié)論

首先通過甲醇、丙酮和乙醇3種溶劑對利普司他汀的提取收率及產(chǎn)品純度考察，確立乙醇為最佳實驗浸提溶劑。然后，通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗，確定了毒三素鏈霉菌中利普司他汀的最佳提取工藝條件：液料比6.32∶ 1 mL/g、乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、浸提時間3.61 h、浸提溫度25 ℃、浸提次數(shù)1次，在該條件下，利普司他汀提取收率的平均值為83.35%。該研究結(jié)果為利普司他汀提取工藝的生產(chǎn)放大提供了有力參考，具有較強的應(yīng)用價值。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Optimization of lipstatin extraction fromStreptomycestoxytriciniby response surface methodology

YAN Tongshun1,YANG Jinyan2,WANG Fang1,ZHU Jianan1

(1.National Engineering Research Center of Chiral Drugs,Lunan Pharmaceutical Group Corporation, Linyi 276006,China; 2.School of Life Science,Linyi University,Linyi 276000,China)

Response surface methodology was used to optimize the extraction conditions of lipstatin fromStreptomycestoxytricini.First,ethanol was established as the best solvent.The extraction yield of lipstatin was the index,ratio of solid to solvent,ethanol concentration,extraction time,extraction temperature and extraction numbers were studied as factors by extraction solvent ethanol.Based on the single factor experiments,the effects of ratio of solid to solvent,ethanol concentration,extraction time,as well as their interactions on extraction yield of lipstatin were studied by Box-Behnken design.The optimal extraction conditions of lipstatin fromStreptomycestoxytriciniwere as follows: the ratio of solid to solvent was 6.32∶ 1 mL/g,ethanol concentration was 95%,extraction time was 3.61 h.Under these conditions,the model-predicted and experimental values of lipstatin yield were 83.35% and 84.50%,respectively,revealing 1.36% relative error between them.

Streptomycestoxytricini; lipstatin; extraction; single factor optimization; respose surface analysis

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.010

2016-10-19

國家科技支撐計劃(2014BAI16B01)

閆同順(1977—)，男，山東昌樂人，高級工程師，研究方向：生化藥物的分離、純化，E-mail：yantongshun@lunan.cn

Q936； TQ464

A

1672-3678(2017)01-0063-06