王杰鵬，羅 瑤，郗大興

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攪拌和通氣對裂殖壺菌LX0809產DHA的影響

王杰鵬，羅 瑤，郗大興

(吉林省?，斏锟萍加邢薰荆诌|源136200 )

利用一株生產DHA專利菌株裂殖壺菌LX0809，在10 L全自動發(fā)酵罐中考察了16個攪拌轉速和通氣量組合對裂殖壺菌LX0809發(fā)酵產DHA的影響。生物量和總油脂的產量隨攪拌轉速和通風量的增加而增加，DHA占總油脂比例隨攪拌轉速和通風量的增加而降低，最終確定通氣量為全程0.3 m3/h(通氣比0.83)，攪拌轉速為前40 h 400 r/min，后56 h 300 r/min。發(fā)酵96 h放罐，細胞生物量92 g/L，油脂質量濃度52.3 g/L，DHA占總油脂含量為40.2%，DHA發(fā)酵產量高達21 g/L。

裂殖壺菌；DHA；發(fā)酵；攪拌；通氣

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，簡稱DHA)，屬于n-3系列長鏈多不飽和脂肪酸，是大腦神經視覺細胞中重要脂肪酸成分，占大腦脂肪酸的25%～33%。DHA在胎兒和嬰幼兒大腦及視覺系統(tǒng)發(fā)育過程中占有重要地位[1-3]。同時DHA有提高機體免疫力、阻止腫瘤細胞的異常增生[4-6]、降低心血管疾病發(fā)生概率等作用[7-8]。

DHA主要來源有南極磷蝦油、深海魚油和DHA藻油[9]。DHA藻油是唯一得到美國FDA認可的兒童DHA補充劑來源，有DHA含量大于35%和大于40%兩種產品規(guī)格。DHA藻油的發(fā)酵菌株主要有裂殖壺菌、吾肯氏壺藻[10]和寇氏隱甲藻等。裂殖壺菌由于其生長繁殖快、發(fā)酵周期短、抗剪切力強、油脂產量高等優(yōu)點，是發(fā)酵法生產DHA藻油的理想菌株。

生物量、總油脂產量和DHA占總油脂含量是評價裂殖壺菌發(fā)酵法生產DHA藻油的主要指標。本文中，筆者擬通過2因素4水平研究攪拌轉速和通氣量對發(fā)酵結果的影響，并通過攪拌轉速分段控制實驗來獲得最優(yōu)的發(fā)酵條件。

1 材料和方法

1.1 菌株

裂殖壺菌LX0809，由本企業(yè)篩選保藏。保藏號：CGMCC No.3535，已獲菌種專利[11]授權。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨5，Na2SO412，MgSO42，KH2PO41，CaCl20.3。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉15，谷氨酸鈉20，MgSO45，KH2PO45，Na2SO412，CaCl20.6；微量元素(mol/L)為泛酸鈣5×10-6、硼酸5×10-6、VB121×10-6、MnCl2·4H2O 5×10-6、ZnSO4·7H2O 5×10-6、CoCl2·6H2O 1×10-6、Na2MoO4·2H2O 1×10-6、CuSO4·5H2O 3×10-6、 NiSO4·6H2O 3×10-6、FeSO4·7H2O 3×10-6。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖濃度的檢測方法

取1 mL發(fā)酵液用去離子水定容到一定體積，取1 mL稀釋液10 000 r/min離心5 min，使用生物傳感分析儀SBA-40D(山東省科學院)檢測上清液葡萄糖濃度。

1.3.2 生物量的檢測方法

取10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min后棄上清液，再用10 mL去離子水懸浮菌體，然后10 000 r/min離心5 min棄上清液，收集菌體，105 ℃烘干至恒質量稱量。

1.3.3 總油脂產量的檢測方法

取1 g干燥菌粉加入20%HCl溶液7 mL，75 ℃水浴振蕩40 min后，用20 mL正己烷抽提脂質，真空旋轉蒸發(fā)器去盡溶劑，得到脂質稱量[12]。

1.3.4 DHA占總油脂含量的檢測方法

油樣的脂肪酸甲酯化方法、安捷倫7890B氣相檢測方法和DHA甘油三酯質量百分含量計算方法，參照GB26400—2011食品添加劑 二十二碳六烯酸油脂(發(fā)酵法)。

1.4 10 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

10 L全自動不銹鋼發(fā)酵罐(上海保興)中裝液量為6 L，121 ℃原位在線滅菌20 min。發(fā)酵接種量為5%，罐壓為0.05 MPa，溫度為28 ℃，發(fā)酵pH為6.0,使用5 mol/L NaOH和2 mol/L H2SO4水溶液自動調節(jié)pH，殘?zhí)琴|量濃度低于10 g/L開始流加600 g/L葡萄糖，并保持殘?zhí)琴|量濃度為10 g/L左右，攪拌轉速和通氣量根據實驗方案設置。

2 結果與討論

2.1 攪拌轉速和通氣量對發(fā)酵結果的影響

DHA藻油的產品質量標準主要有35%和40%兩種。如果發(fā)酵液中DHA含量低于40%，則必須經過冬化工藝以提高藻油中DHA含量到40%以上。為了探索在發(fā)酵液中提高DHA含量到40%的最優(yōu)發(fā)酵條件，考察攪拌轉速和通氣量對DHA生產的影響。在10 L發(fā)酵罐中考察攪拌轉速(r/min)：200、300、400、500和通氣量(m3/h)：0.2、0.3、0.4、0.5(對應通氣比：0.56、0.83、1.11、1.39)，借助正交分析的方法研究2個因素各4個水平的16個組合對裂殖壺菌LX0809發(fā)酵產DHA藻油的生物量(dry cell weight)、總油脂產量(total fatty acids)、DHA占總油脂含量3個指標的影響。除攪拌和通氣外，所有實驗條件都相同，發(fā)酵實驗結果如下表1所示，正交結果分析如表2所示。

表1 發(fā)酵實驗結果

表2 正交試驗結果分析

借助正交分析方法研究攪拌和通氣對發(fā)酵結果的影響，優(yōu)選當DHA質量分數為40%，同時獲得盡可能多的總油脂產量的發(fā)酵工藝條件。

(a) 以生物量為指標，隨著攪拌速度和通氣量的提高，生物量越大；并且攪拌速度極差為72.75，大于通氣量所得極差27.50，說明攪拌轉速對生物量的影響效果更明顯。

(b) 以總油脂產量為指標，隨著攪拌速度和通氣量的提高，總油脂的產量越大；并且攪拌速度極差為54.175，大于通氣量所得極差20.050，說明攪拌轉速對總油脂產量的影響效果更明顯。

(c) 以DHA占總油脂含量為指標，隨著攪拌速度和通氣量的提高，DHA占總油脂含量越低；攪拌速度極差大小為11.325，大于通氣量所得極差3.925，說明攪拌轉速對DHA占總油脂含量的影響效果更明顯。

綜上所述，通過攪拌和通氣調節(jié)DHA發(fā)酵過程的攝氧率，生物量及總油脂產量隨著攪拌和通氣的增大而增加，而DHA占總油脂的含量隨著攪拌和通氣的增大而降低。其中攪拌的影響效果明顯大于通氣，當攪拌速度為200和300 r/min時，DHA質量分數可以達到40%，但是生物量和總油脂產量偏少。

2.2 攪拌速度分段控制實驗

裂殖壺菌發(fā)酵生產DHA油脂主要分為兩個階段：生長繁殖階段和油脂積累階段[13]。生物合成DHA的代謝路徑主要有依賴O2的脂肪酸合成(FAS)途徑和不依賴O2的多聚乙酰合成酶(PKS)途徑[13-14]。研究表明裂殖壺菌合成DHA的路徑是類似于細菌的PKS途徑[15]，且裂殖壺菌細胞內兩個脂肪酸合成酶系同時存在[12]。攝氧率(OUR)是單位時間內單位體積發(fā)酵液中微生物攝取氧的量，記作r(O2)(mmol/(L·h))，即每小時每升發(fā)酵液的氧氣實際消耗量。發(fā)酵前期主要進行細胞數量積累，油脂含量少，攝氧率高有利于細胞繁殖；在發(fā)酵的中后期油脂積累階段，氮源基本耗盡，細胞繁殖減弱，用于維持細胞增殖的O2需求下降。而PKS途徑不依賴O2，因此發(fā)酵中后期攝氧率相對大小能夠反映細胞用于中短鏈飽和脂肪酸合成的FAS酶系的活力相對強弱。所以通過改變通氣和攪拌調節(jié)發(fā)酵體系攝氧率，可以調節(jié)FAS路徑的合成效率。攝氧率低有利于抑制中短鏈飽和脂肪酸合成，進而改變油脂中脂肪酸的組成比例。

本實驗考察發(fā)酵前期400 r/min、后期300 r/min，分段轉速控制對裂殖壺菌發(fā)酵產DHA藻油的影響。發(fā)酵40 h左右，氮磷源基本耗盡(數據未顯示)，因此攪拌轉速切換時間選擇為40 h。由于通氣對發(fā)酵結果的影響相對偏小，通風量全程為0.3 m3/h(通氣比0.83)。分段轉速控制發(fā)酵結果如表3所示，分段轉速控制發(fā)酵代謝曲線如圖1所示。

表3 攪拌分段控制發(fā)酵結果

圖1 攪拌分段控制發(fā)酵代謝曲線Fig.1 Metabolic curve of the stepwise agitation fermentation

由圖1可知：通過攪拌轉速的分段控制，在前40 h生長繁殖階段，攪拌轉速為400 r/min，40 h左右細胞進入油脂積累階段，攪拌轉速降為300 r/min。發(fā)酵96 h放罐，DHA占總油脂含量由48 h的37.3%提高到40.2%，生物量由48 h的58 g/L提高到92 g/L，總油脂產量從48 h的25.2 g/L提高到52.3 g/L，發(fā)酵后期48 h生物量的增長量基本都是油脂的積累。在過低的攪拌轉速下，盡管DHA含量較高，達到44.3%，卻導致細胞繁殖數量偏少，在96 h放罐時生物量和總油脂產量較低。

Ren等[15-16]報道在1.5 t發(fā)酵罐中發(fā)酵132 h，生物量71 g/L，總油脂產量35.17 g/L，DHA占總油脂含量44.82%，DHA產量15.76 g/L。本研究通過優(yōu)化攪拌轉速和通氣量，發(fā)酵96 h生物量92 g/L，總油脂產量52.3 g/L，DHA占總油脂含量40.2%，DHA產量21 g/L。該發(fā)酵技術發(fā)酵周期短，且可以不經冬化工藝直接生產含量40%以上的DHA藻油，具有明顯的競爭優(yōu)勢。

3 結論

本研究采用前40 h攪拌速度400 r/min，后56 h攪拌速度300 r/min的分段轉速控制工藝，通氣0.3 m3/h(通氣比0.83)，裂殖壺菌LX0809發(fā)酵96 h，生物量和總油脂僅略低于轉速400 r/min、通氣0.3 m3/h(通氣比0.83)的實驗，但是DHA的含量達到40.2%；DHA的含量略低于轉速全程300 r/min、通氣0.3 m3/h(通氣比0.83)的實驗，但是生物量達到92 g/L，總油脂產量達到52.3 g/L。既保證發(fā)酵96 h生物量和總油脂產量較高，也使DHA占總油脂含量達到40%。除攪拌和通氣外，發(fā)酵罐中攝氧率還可能受到培養(yǎng)基、發(fā)酵溫度、罐壓、發(fā)酵罐結構等因素影響，后續(xù)將圍繞攝氧率對裂殖壺菌LX0809發(fā)酵產DHA藻油的影響進行更加深入的研究。

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(責任編輯 管珺)

Effects of agitation and aeration on DHA production bySchizochytriumLX0809

WANG Jiepeng， LUO Yao， XI Daxing

(JiLin Xima Biotechnology Co.,Ltd.,Liaoyuan 136200,China)

StrainSchizochytriumLX0809 that could accumulate DHA was used in this study.The effects of agitation and aeration on DHA production were investigated in a 10-L fermenter with 16 fermentation experiments.Dry cell weight and total fatty acids increased with the increase of agitation and aeration,whereas DHA content decreased with the increase of agitation and aeration.Total fatty acids and DHA content increased under the optimal condition when the aeration was 0.3 m3/h,and agitation was kept at 400 r/min for the first 40 h and 300 r/min for latter 56 h.Dry cell weight,DHA in total fatty acids, DHA content and the DHA yield reached 92 g/L,52.3 g/L,40.2% and 21 g/L,respectively.

Schizochytrium; DHA; fermentation; agitation; aeration

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.01.003

2016-03-10

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃) (2014AA021701)

王杰鵬(1984—)，男，四川綿陽人，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：wangjiepeng1999@163.com

R282.71

A

1672-3678(2017)01-0016-04