王 佐，王 璐，陳忠正*，勞 揚，劉杏宜，高 雄，燕 妮，林曉蓉，張媛媛，李 斌*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

冬凌草甲素誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞醌還原酶活性及其機理研究

王 佐，王 璐，陳忠正*，勞 揚，劉杏宜，高 雄，燕 妮，林曉蓉，張媛媛，李 斌*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

為篩選鑒定出溪黃草中抗癌活性組分，本研究以溪黃草為材料得到乙酸乙酯提取物，通過硅膠柱層析、半制備色譜分離純化，利用小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7體外模型測定分離產(chǎn)物對細胞存活率和醌還原酶（quinone reductase，QR/NAD(P)H: reductase 1，NQO1）誘導(dǎo)活性。通過核磁共振、質(zhì)譜分析鑒定組分結(jié)構(gòu)；采用細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）p38、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）5 種蛋白激酶的特異性抑制劑，確定冬凌草甲素誘導(dǎo)QR活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，采用實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）和Western blot法分別檢測NQO1的mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果：1）從溪黃草中篩選鑒定出一較強誘導(dǎo)QR活性組分為冬凌草甲素；2）冬凌草甲素質(zhì)量濃度為0.94 μg/mL時，即可誘導(dǎo)QR活性倍增；3）PI3K抑制劑處理顯著抑制冬凌草甲素誘導(dǎo)的QR活性，而ERK抑制劑處理顯著促進冬凌草甲素誘導(dǎo)的QR活性，但PKC、p38和JNK抑制劑處理對冬凌草甲素誘導(dǎo)的QR活性無明顯影響；4）冬凌草甲素顯著提高細胞內(nèi)NQO1的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)論：溪黃草中的冬凌草甲素具有抗癌活性，其抗癌活性通過提高Hepa1c1c7細胞中NQO1基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平以增加QR活性實現(xiàn)，并且其抗癌功能主要通過激活PI3K通路、抑制ERK通路進行信號傳導(dǎo)。研究結(jié)果為深入開展溪黃草和冬凌草甲素的癌癥化學(xué)預(yù)防研究奠定前期理論基礎(chǔ)。

溪黃草；冬凌草甲素；醌還原酶；Hepa1c1c7細胞株；信號通路

隨著環(huán)境污染的日益嚴重和人們生活習慣的改變，癌癥已成為世界范圍內(nèi)引起死亡的主要原因[1]。1991年哥倫比亞大學(xué)癌癥研究中心Weinstein[2]指出，30%以上的癌癥是可以預(yù)防的。Sporn[3]首次提出癌癥化學(xué)預(yù)防的概念，即：在飲食和藥物治療中加入某些天然或合成化學(xué)物質(zhì)，通過逆轉(zhuǎn)或延遲癌癥發(fā)生的各個階段來降低癌癥的發(fā)生。機體在各階段都形成了預(yù)防細胞發(fā)生癌變的代謝體系，主要包括Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝體系。Ⅰ相代謝可能活化某些致癌物前體，而Ⅱ相代謝能夠使致癌物徹底解毒失活。參與Ⅱ相代謝過程的酶統(tǒng)稱為Ⅱ相酶，常見的Ⅱ相酶包括醌還原酶。醌還原酶（quinone reductase，QR/NAD(P)H: reductase 1，NQO1）是一種黃素蛋白酶，它以NADP（H）為受體，催化醌類及其衍生物失去兩個電子，從而保護細胞免受醌類物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的活性氧及親電物質(zhì)的損傷[4-5]。由于QR催化的反應(yīng)底物非常廣泛，具有與其他Ⅱ相酶協(xié)同增效的作用，對誘導(dǎo)劑具有良好的響應(yīng)性，所以其活性被認為是癌癥化學(xué)預(yù)防的重要指標，被廣泛用作篩選誘導(dǎo)Ⅱ相酶活性物質(zhì)的生物標記物[6]，因此從天然植物中篩選具有較強誘導(dǎo)QR活性組分對癌癥化學(xué)預(yù)防具有重要意義。對于QR代謝，核轉(zhuǎn)錄E2相關(guān)因子2-Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1-抗氧化反應(yīng)元件（nuclear factor erythroid-2 related factor 2-Kelch-like ECH-associated protein 1-antioxidant response element，Nrf2-Keap1-ARE）是最主要的信號通路[3]。該信號通路包括抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）、核轉(zhuǎn)錄E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）和Kelch樣ECH相關(guān)蛋白 l（Kelch-like ECH-associated protein l，Keap1）。在正常生理條件下，Nrf2被Keap1錨定于細胞質(zhì)中，處于不斷降解的非活性狀態(tài)，Nrf2的激活依賴于蛋白磷酸化作用，而這些蛋白磷酸化作用主要受蛋白激酶的調(diào)控。Nrf2被激活后與Keap1解離并入核積累，參與QR表達調(diào)控。目前研究中對QR代謝起調(diào)控作用的蛋白激酶主要有：絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、PKC和PI3K[7]，其中MAPKs包括3 個主要亞族：細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、 c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38[8]。天然活性成分誘導(dǎo)QR作用也體現(xiàn)在促進NQO1基因轉(zhuǎn)錄翻譯方面[9-11]。由于誘導(dǎo)QR活性是細胞內(nèi)多通路共同作用的復(fù)雜過程，因此研究QR代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和NQO1基因轉(zhuǎn)錄翻譯以預(yù)防癌癥的發(fā)生具有積極意義。

溪黃草Rabdosia serra (Maxim) Hara是唇形科香茶菜屬植物干燥的地上部分，主產(chǎn)于廣東、福建、廣西和江西等地[12]，主要含有萜類、黃酮類、揮發(fā)油、甾醇類、微量元素、香豆素類、酚類等多種化學(xué)成分[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)溪黃草具有抗癌、抗炎、抑菌、抗病毒[14-17]等多種功效。

本研究以溪黃草為材料，利用小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7體外模型，通過提取、分離純化，對分離產(chǎn)物測定細胞存活率和QR誘導(dǎo)活性，篩選出具有較強誘導(dǎo)QR活性組分，并通過核磁共振、質(zhì)譜分析鑒定其結(jié)構(gòu)。采用ERK抑制劑（PD98059）、PI3K抑制劑（Wortmannin）、p38抑制劑（SB203580）、PKC抑制劑（G?6983）和JNK抑制劑（SP600125）5 種特異性蛋白激酶抑制劑確定誘導(dǎo)QR活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）和Western blot法分別檢測NQO1的mRNA和蛋白表達水平，為從天然植物中篩選抗癌組分并研究其作用機理以預(yù)防癌癥的發(fā)生提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溪黃草 廣州采芝林藥業(yè)；冬凌草甲素標準品（純度≥98%） 北京普博欣生物科技有限公司；小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7 美國模式培養(yǎng)物儲存庫。

α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、杜爾貝科磷酸鹽緩沖鹽水（dulbecco phosphatebuffered saline，DPBS） 美國Life公司；四甲基偶氮唑藍、甲萘醌、6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、洋地黃皂苷 美國Sigma公司；結(jié)晶紫 美國Genview公司；柱層析硅膠粉（200～300 目） 青島譜科試劑有限公司；細胞總蛋白抽提試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)研究所；聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、封閉液、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體 美國Thermo公司； NQO1的兔抗小鼠抗體 美國Abcam公司；β-actin兔抗小鼠抗體、ERK1/2抑制劑（PD98059） 美國Cell Signaling Technology公司；PI3K抑制劑（Wortmannin）、p38抑制劑（SB203580）、PKC抑制劑（G?6983）、JNK抑制劑（SP600125） 美國Merck公司；Trizol提取試劑盒、4S Red Plus核酸染色劑、瓊脂糖、第一鏈cDNA合成試劑盒上海生工生物有限公司；活性炭、乙酸乙酯、石油醚均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max Plus酶標儀 美國Molecular Devices公司；HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；Ckx41顯微鏡 日本Olympus公司；LC300高效液相色譜儀 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司； 1200高效液相色譜儀、6430質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；AV 600核磁共振儀 瑞士Bruker Biospin AG公司；PCR反應(yīng)擴增儀、垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)漕 美國Bio-Rad公司；OmegaLumG自動化學(xué)發(fā)光儀 美國Aplegen公司；Stepone Plus型熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 溪黃草抗癌組分提取分離

1.3.1.1 溪黃草乙酸乙酯提取和硅膠柱層析分離

用乙酸乙酯溶劑提取溪黃草樣品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、氮吹干燥制成初提取樣品。取初提取樣品5 g，乙酸乙酯溶解，加入15 g硅膠吸附。用6 cm×60 cm層析柱進行分離，干法上樣，以石油醚-乙酸乙酯體積比1∶1濕法裝柱，采用體積比1∶1、1∶3、1∶5以及0∶1的石油醚-乙酸乙酯體系依次梯度洗脫、收集。于254 nm波長處測定吸光度，分別濃縮、干燥。

1.3.1.2 溪黃草硅膠柱層析產(chǎn)物半制備色譜分離純化

色譜柱為Z O R B A X E c l i p s e X D B-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇和水；進樣量50 μL；流速2 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm。甲醇-水體積比1∶1洗脫20 min后，變?yōu)榧状?水體積比17∶3洗脫。

1.3.2 溪黃草抗癌組分結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.2.1 溪黃草半制備色譜分離產(chǎn)物高效液相色譜分析

取樣品0.1 mg，溶于1 mL色譜級甲醇中，0.22 μm濾頭過濾。色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為甲醇和水；進樣量10 μL；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長254 nm。甲醇-水體積比11∶9洗脫30 min后，變?yōu)榧状?水體積比14∶6洗脫。

1.3.2.2 溪黃草半制備色譜分離產(chǎn)物核磁共振、質(zhì)譜分析

稱取樣品7 mg，用0.5 mL氘代甲醇溶解，采用AV 600核磁共振儀進行氫譜、碳譜掃描。稱取樣品0.1 mg，用1 mL甲醇溶解，并用0.22 μm的濾頭過濾，質(zhì)譜離子源為正離子ESI掃描，進樣量5 μL。

1.3.3 細胞培養(yǎng)

小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7經(jīng)解凍復(fù)蘇后，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為89% α-MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清（經(jīng)熱處理和活性炭吸附）、1%青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 μg/mL），每3～4 d繼代一次。

1.3.4 誘導(dǎo)QR活性測定

參照Prochaska等[18]的方法。接種細胞：取Hepa1c1c7細胞接種于96 孔板，5×103個細胞/孔，于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加樣：棄去舊培養(yǎng)液后，含抑制劑預(yù)處理組先添加含不同質(zhì)量濃度抑制劑的新鮮培養(yǎng)液150 μL/孔，預(yù)處理3 h后棄去，再添加含有1.25 μg/mL冬凌草甲素的新鮮培養(yǎng)液，150 μL/孔培養(yǎng)48 h；非抑制劑預(yù)處理組直接添加含不同質(zhì)量濃度的溪黃草分離組分或1.25 μg/mL冬凌草甲素的新鮮培養(yǎng)液，150 μL/孔培養(yǎng)48 h；測定：棄去舊培養(yǎng)液，每孔加50 μL的0.08 g/100 mL洋地黃皂苷（含2 mmol/mL乙二胺四乙酸溶液），輕微振蕩30 min。用酶標儀測定490 nm波長處10 min內(nèi)反應(yīng)液中噻唑藍吸光度，繪制動力學(xué)曲線。另備份一塊96 孔板，棄掉舊培養(yǎng)液，結(jié)晶紫溶液染色15 min，棄去；十二烷基硫酸鈉溶解1 h，用酶標儀測定610 nm波長處吸光度。樣品的相對QR誘導(dǎo)活性用CD值（concentration to double relative QR specif i c activity）表示，定義為使相對QR誘導(dǎo)活性值達到倍增時對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度；以細胞活力（cell viability，CV）＞0.5（即IC50＞50%）和相對QR活性≥2作為樣品具有QR誘導(dǎo)活性的篩選指標，測定樣品重復(fù)2 次以上。

1.3.5 定量PCR檢測mRNA表達水平

接種細胞：取Hepa1c1c7細胞接種于6 孔板，5×105個細胞/孔，于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加樣：棄去舊培養(yǎng)液，添加含不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素的新鮮培養(yǎng)液，2 mL/孔，培養(yǎng)48 h；總RNA提取：棄去舊培養(yǎng)液后，用Trizol提取試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計分別測定OD260nm及OD280nm，要求OD260nm/OD280nm比值介于1.8～2.0，根據(jù)OD260nm計算總RNA含量，-80 ℃保存?zhèn)溆?；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按試劑盒說明，在PCR管中加入RNA 800 ng和隨機引物p(dN)6（0.2 μg/μL）1 μL，用不含RNA酶的雙蒸水定容至13 μL；70 ℃溫浴5 min，冰浴10 s，離心后加入5×反應(yīng)緩沖液4 μL、dNTP混合液（10 mmol/L）2 μL、RNA酶抑制劑（20 U/μL）1 μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶（10 U/μL）2 μL；37 ℃溫浴5 min，42 ℃溫浴60 min，70 ℃溫浴10 min后終止反應(yīng)，將上述溶液-20 ℃保存；熒光定量PCR檢測：采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計NQO1、GADPH基因的引物序列，具體見表1，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物；PCR反應(yīng)體系為2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Template （cDNA）7.2 μL、10 μmol/L的FP和RP各0.4 μL，加雙蒸水定容至20 μL；PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，隨后95 ℃變性7 s，57 ℃退火10 s，共40 個循環(huán)。

表1 目的基因和內(nèi)參基因PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences for target gene and reference gene

1.3.6 Western blot法檢測蛋白表達量

接種細胞：取Hepa1c1c7細胞接種于6 孔板，5×105個細胞/孔，于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加樣：棄去舊培養(yǎng)液，添加含不同濃度冬凌草甲素的新鮮培養(yǎng)液，2 mL/孔，按實驗所需培養(yǎng)一定時間；收集細胞總蛋白：取出培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗3 遍，用細胞刮刀刮下細胞并離心收集細胞后，每孔加入200 μL添加了苯甲基磺酰氟（1 mmol/L）的細胞裂解液，充分裂解后，14 000×g離心5 min，取上清液即為抽提得到的細胞總蛋白；蛋白濃度定量：將BCA試劑A與B按50∶1的比例混合，配制成BCA工作液；取適當體積樣品到96 孔板的樣品孔中，每孔加入200 μL BCA工作液，混勻，37 ℃放置30 min；取出96 孔板，562 nm波長處測定吸光度，根據(jù)牛血清白蛋白標準曲線計算出各樣品的蛋白濃度；檢測蛋白表達：將蛋白抽提液與上樣緩沖液按體積比4∶1混合，沸水浴5 min后，-80 ℃貯存?zhèn)溆茫徊捎镁郾０蹦z電泳法，按照實驗需要先后配制分離膠和濃縮膠；取蛋白樣品各20 μg上樣，電壓90 V電泳40 min后轉(zhuǎn)換電壓120 V電泳150 min；在200 mA條件下轉(zhuǎn)膜45 min將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用Western blot緩沖溶液漂洗3 次（每次5 min）后，將PVDF膜置于封閉液中室溫封閉2 h；將膜置于含稀釋后一抗的封閉液中（一抗的與封閉液的比例為1∶2 000，后同），4 ℃孵育過夜；洗膜后加入TBST溶液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶20 000），室溫孵育2 h，洗膜后顯影，采用自動化學(xué)發(fā)光儀進行掃描并記錄條帶光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析；采用ABI 7500 system SDS Software 1.4進行熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理，以GADPH為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計算基因轉(zhuǎn)錄的相對變化；采用FluorChem進行蛋白質(zhì)條帶光密度值積分，以β-actin為內(nèi)參蛋白做相對定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溪黃草抗癌組分提取分離

2.1.1 溪黃草乙酸乙酯提取物抗癌活性

圖1 溪黃草乙酸乙酯提取物誘導(dǎo)QR活性Fig. 1 Induction of QR activity by ethyl acetate extracts from Rabdosia serra (Maxim) Hara

采用乙酸乙酯提取溪黃草，利用小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7進行相對QR活性測定結(jié)果由圖1可知，溪黃草乙酸乙酯提取物在7.81～15.63 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相對QR活性倍增。表明溪黃草此提取物具有較強的抗癌活性，進而對該提取物進行分離純化。

2.1.2 溪黃草硅膠柱層析分離產(chǎn)物及抗癌活性

溪黃草乙酸乙酯提取物經(jīng)硅膠柱層析分離純化，以石油醚-乙酸乙酯體系梯度洗脫，根據(jù)每管在254 nm波長處的吸光度繪制變化曲線，收集合并餾分依次標記為F1～F5，5 組分經(jīng)誘導(dǎo)QR活性測定均具有抗癌活性，其誘導(dǎo)QR活性達到倍增的質(zhì)量濃度均在1.56～6.25 μg/mL范圍內(nèi)，其中組分F5的抗癌活性最強，為分離得到強抗癌活性單體，故本研究選擇組分F5繼續(xù)分離純化。

2.1.3 溪黃草F5組分半制備柱分離產(chǎn)物及抗癌活性

溪黃草F5組分經(jīng)半制備色譜分離，收集其中5 個峰的組分，標記為F5-1～F5-5（圖2），5 個組分誘導(dǎo)QR活性測定結(jié)果見圖3。除F5-1和F5-5外，其余3 個組分均具有強的抗癌活性，其誘導(dǎo)QR達到倍增的質(zhì)量濃度均為1.56～3.13 μg/mL。其中F5-3抗癌活性最強，為明確強抗癌活性單體分子結(jié)構(gòu)，本研究選擇F5-3進行結(jié)構(gòu)鑒定。

圖2 溪黃草F5組分半制備色譜分離圖Fig. 2 Semi-preparative chromatographic analysis of F5 from Rabdosia serra (Maxim) Hara

圖3 溪黃草半制備色譜分離產(chǎn)物誘導(dǎo)QR活性Fig. 3 Induction of QR activity by isolated fractions with semipreparative chromatography from Rabdosia serra (Maxim) Hara

2.2 溪黃草抗癌組分結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 溪黃草抗癌組分HPLC結(jié)果分析

圖4 溪黃草F5-3組分HPLC分析圖譜Fig. 4 High performance liquid chromatographic analysis of F5-3 from Rabdosia serra (Maxim) Hara

對溪黃草半制備色譜分離的F5-3進行HPLC分析，監(jiān)測其在254 nm波長處的出峰情況（圖4），發(fā)現(xiàn)F5-3的峰比較單一，初步推斷其純度相對較高。因此，對F5-3進行了核磁共振、質(zhì)譜分析，從而鑒定其結(jié)構(gòu)。

2.2.2 溪黃草F5-3核磁共振、質(zhì)譜分析結(jié)果

溪黃草F5-3的1H核磁共振、13C核磁共振圖譜如圖5、6所示，根據(jù)質(zhì)子和碳原子在一定條件下所固有的化學(xué)位移值和積分曲線高度，結(jié)合溪黃草化學(xué)成分波譜數(shù)據(jù)的相關(guān)文獻報道[19]，初步推測該化合物為冬凌草甲素，其分子式為C20H28O6。進一步對溪黃草F5-3進行質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖7所示。經(jīng)解譜分析F5-3的相對分子質(zhì)量為364，與冬凌草甲素的相對分子質(zhì)量相同。故此鑒定溪黃草F5-3為冬凌草甲素，其結(jié)構(gòu)式見圖8。

H-NMR圖譜Fig. 51H-NMR analysis of F5-3 from Rabdosia serra (Maxim) Hara圖5 溪黃草F5-3組分1

C-NMR圖譜Fig. 613C-NMR analysis of F5-3 from Rabdosia serra (Maxim) Hara圖6 溪黃草F5-3組分13

圖7 溪黃草F5-3組分質(zhì)譜圖Fig. 7 Mass spectrum of F5-3 from Rabdosia serra (Maxim) Hara

圖8 冬凌草甲素分子結(jié)構(gòu)式Fig. 8 Molecular structure of oridonin

2.3 冬凌草甲素抗癌機理研究

2.3.1 冬凌草甲素誘導(dǎo)QR活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

為進一步研究冬凌草甲素具有強的誘導(dǎo)QR活性機理，本實驗采用不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素與Hepa1c1c7細胞共孵育48 h后檢測誘導(dǎo)QR活性。結(jié)果如圖9所示，在0.31～2.50 μg/mL范圍內(nèi)，Hepa1c1c7細胞存活率均大于0.50，而冬凌草甲素質(zhì)量濃度為0.94 μg/mL時，即顯著誘導(dǎo)QR活性倍增。

圖9 冬凌草甲素誘導(dǎo)QR活性Fig. 9 Induction of QR activity by oridonin

為了在酶活性水平上確定冬凌草甲素誘導(dǎo)QR活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本實驗先采用5種不同濃度的蛋白激酶抑制劑單獨預(yù)處理細胞3 h后棄去，再添加1.25 μg/mL冬凌草甲素與Hepa1c1c7細胞共孵育，對照組為1.25 μg/mL冬凌草甲素單獨與Hepa1c1c7細胞共孵育，48 h后檢測QR活性。

由圖10可知，在實驗范圍內(nèi)，p38抑制劑預(yù)處理組的誘導(dǎo)細胞QR活性與對照組相比沒有顯著差異，表明冬凌草甲素誘導(dǎo)Hepa1c1c7細胞QR活性不通過p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。同理，冬凌草甲素誘導(dǎo)Hepa1c1c7細胞QR活性也不通過PKC和JNK細胞通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。在2.5～15.0 μmol/L范圍內(nèi)，PI3K抑制劑預(yù)處理組對冬凌草甲素誘導(dǎo)細胞QR活性有極顯著抑制作用（P＜0.01），相對QR活性分別為對照組的0.85、0.87、0.77、0.80 倍，表明冬凌草甲素通過激活PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)Hepa1c1c7細胞QR活性。在20～60 μmol/L濃度范圍內(nèi)，ERK抑制劑預(yù)處理組對冬凌草甲素誘導(dǎo)細胞QR活性有顯著促進作用（P＜0.05，P＜0.01），相對QR活性分別為對照組的1.08、1.12、1.43倍和1.46倍，表明冬凌草甲素通過抑制ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)Hepa1c1c7細胞QR活性。

圖10 5 種蛋白激酶抑制劑對冬凌草甲素誘導(dǎo)QR活性的影響Fig. 10 Effects of fi ve protein kinase inhibitors on the induction of QR activity by oridonin

2.3.2 冬凌草甲素對NQO1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響

圖11 冬凌草甲素作用Hepa1c1c7細胞后對NQO1 mRNA表達的影響Fig. 11 Effect of oridonin on the mRNA expression of NQO1 in Hepa1c1c7 cell line

為進一步證實冬凌草甲素具有較強QR誘導(dǎo)作用，本實驗將不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素作用Hepa1c1c7細胞48 h后，細胞內(nèi)NQO1 mRNA表達情況如圖11所示。在0.0～2.5 μg/mL范圍內(nèi)，隨著冬凌草甲素質(zhì)量濃度增高，實驗組NQO1 mRNA相對表達量分別為對照組的（1.83±0.07）、（3.47±0.28）倍，表明冬凌草甲素顯著促進NQO1 mRNA表達。

圖12 冬凌草甲素作用Hepa1c1c7細胞后對NQO1蛋白表達的影響Fig. 12 Effect of oridonin on the protein expression of NQO1 in Hepa1c1c7 cell line

不同質(zhì)量濃度冬凌草甲素作用Hepa1c1c7細胞48 h后，細胞內(nèi)NQO1蛋白表達的情況如圖12所示。實驗組細胞中NQO1蛋白相對表達量隨冬凌草甲素質(zhì)量濃度增加而升高，呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，分別達到對照組表達量的（1.18±0.02）、（2.16±0.01）、（2.56±0.15）倍。在1.5～2.5 μg/mL范圍內(nèi)，實驗組顯著上調(diào)NQO1蛋白的表達水平。以上結(jié)果表明，冬凌草甲素可以上調(diào)Hepa1c1c7細胞中NQO1 mRNA及其蛋白的表達水平。

李廣義等[20]從溪黃草中分離出冬凌草甲素，其主要具有抗癌、抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等作用[21-30]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)溪黃草中的冬凌草甲素具有強的誘導(dǎo)QR活性，而對QR代謝起調(diào)控作用的蛋白激酶主要有p38、PKC、JNK、PI3K和ERK，抗癌活性物質(zhì)對這5 種蛋白激酶的調(diào)控分別在相應(yīng)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。因此本研究針對上述5 種蛋白激酶和NQO1基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯展開冬凌草甲素抗癌機理研究。結(jié)果表明，冬凌草甲素通過激活PI3K活性、抑制ERK活性、不影響p38、PKC、JNK活性的方式誘導(dǎo)Hepa1c1c7細胞QR活性。冬凌草甲素顯著促進NQO1基因轉(zhuǎn)錄及翻譯。綜上所述，溪黃草中的冬凌草甲素，在酶活性水平上，通過激活PI3K通路、抑制ERK通路，顯著提高Hepa1c1c7細胞QR活性；在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，顯著促進NQO1基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，從而誘導(dǎo)QR活性顯著倍增，顯示出強的抗癌活性。

3 結(jié) 論

本研究提取、分離、純化溪黃草乙酸乙酯提取物，利用小鼠肝癌細胞Hepa1c1c7體外模型，通過核磁共振、質(zhì)譜分析，篩選鑒定出具有較強誘導(dǎo)QR活性的F5-3組分為冬凌草甲素，其誘導(dǎo)QR倍增質(zhì)量濃度范圍為1.56～3.13 μg/mL。冬凌草甲素質(zhì)量濃度為0.94 μg/mL時顯著誘導(dǎo)QR活性倍增。1.25 μg/mL冬凌草甲素經(jīng)10 μmol/L的PI3K抑制劑處理后抑制QR活性最明顯，經(jīng)60 μmol/L的ERK抑制劑處理后促進QR活性最明顯，測得QR活性分別為冬凌草甲素單獨處理組的0.77 倍和1.46 倍。冬凌草甲素不通過p38、PKC和JNK信號通路影響QR活性。冬凌草甲素2.5 μg/mL顯著促進Hepa1c1c7細胞中NQO1的mRNA表達水平和蛋白表達量，相對表達量分別為對照組的3.47 倍和2.56 倍。

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Oridonin-Induced Quinone Reductase Activity and Its Mechanism in Mouse Hepatoma Hepa1c1c7 Cells

WANG Zuo, WANG Lu, CHEN Zhongzheng*, LAO Yang, LIU Xingyi, GAO Xiong, YAN Ni, LIN Xiaorong, ZHANG Yuanguan, LI Bin*
(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

To screen and identify the anticancer components of Rabdosia serra (Maxim) Hara, the effects of the crude ethyl acetate extract of Rabdosia serra (Maxim) Hara and its purif i ed fractions obtained by silica gel column chromatography and semi-preparative chromatography on cell viability and quinone reductase (QR/NQO1) activity were evaluated using mouse hepatoma Hepa1c1c7 cells. The purif i ed fractions were identif i ed by mass spectrometry (MS),1H-nuclear magnetic renonsance (1H-NMR) and13C-NMR. Furthermore, mouse hepatoma cells were pretreated with specific protein kinase inhibitors including phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor, extracellular signal-regulated kinase (ERK) inhibitor, mitogen activated protein kinases(MAPK) p38 inhibitor, protein kinase C (PKC) inhibitor and c-Jun N-terminal kinase (JNK) inhibitor to determine the signal transduction pathways leading to the induction of QR activity. The mRNA and protein expression levels of NQO1 were measured by quantitative PCR and Western blot, respectively. Our results suggested as follows: 1) oridonin was identif i ed as a potential anticancer component of this extract; 2) oridonin at a concentration of 0.94 μg/mL exhibited a remarkable potency in inducing QR; 3)PI3K inhibitor signif i cantly inhibited the induction of QR activity by oridonin, while ERK inhibitor showed an opposite effect. Moreover, p38, PKC and JNK inhibitors did not signif i cantly affect the induction effect of oridonin on QR; 4)oridonin markedly increased the expression of both mRNA and protein of NQO1. In conclusion, oridonin from Rabdosia serra (Maxim) Hara can induce QR activity in cultured Hepa1c1c7cells by activating the PI3K signal transduction pathway and inhibiting the ERK signal transduction pathway, and it also can signif i cantly induce the transcription and translation of NQO1. These results would provid a preliminary theoretical basis for cancer chemoprevention with Rabdosia serra (Maxim) Hara and oridonin.

Rabdosia serra (Maxim) Hara; oridonin; quinone reductase; Hepa1c1c7 cell line; signal transduction pathway

10.7506/spkx1002-6630-201707031

Q257

A

1002-6630（2017）07-0193-08

2016-04-06

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-23）

王佐（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)。E-mail：937024730@qq.com

*通信作者：陳忠正（1974—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：Zhongzhengch@scau.edu.cn李斌（1960—），女，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與營養(yǎng)。E-mail：bli@scau.edu.cn

王佐, 王璐, 陳忠正, 等. 冬凌草甲素誘導(dǎo)小鼠肝癌細胞醌還原酶活性及其機理研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 193-200. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707031. http://www.spkx.net.cn

WANG Zuo, WANG Lu, CHEN Zhongzheng, et al. Oridonin-induced quinone reductase activity and its mechanism in mouse hepatoma Hepa1c1c7 cells[J]. Food Science, 2017, 38(7): 193-200. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201707031. http://www.spkx.net.cn