劉冬涵，王炎，田玉欣，白少娟，陳曉怡，趙怡程，周揚，何婷，折改梅

(北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100102)

苦菜地上部分總黃酮富集工藝研究

劉冬涵，王炎，田玉欣，白少娟，陳曉怡，趙怡程，周揚，何婷，折改梅*

(北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100102)

以總黃酮回收率為指標，通過靜態(tài)吸附和解吸附篩選最佳樹脂，確立苦菜地上部分總黃酮的富集純化工藝。通過靜態(tài)吸附與解吸附對9種不同極性的大孔樹脂進行篩選，優(yōu)化最佳樹脂的上樣pH值、上樣濃度、上樣流速、洗脫流速、洗脫濃度、洗脫體積和徑高比等工藝參數(shù)。AB-8樹脂是富集純化苦菜地上部分總黃酮的最佳樹脂，最佳工藝參數(shù)為：上樣pH值為pH=5.0，上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL，吸附流速為2 mL/min，解吸附流速為3 mL/min，乙醇洗脫液的濃度為70%，洗脫體積為2 BV，樹脂柱徑高比為1∶10，大孔樹脂最多重復使用3次，總黃酮純度倍數(shù)為2.43。AB-8型大孔樹脂能有效地富集純化苦菜地上部分總黃酮。

大孔樹脂；苦菜；總黃酮

苦菜(SonchusarvensisL.)為菊科(Compositae)苦苣菜屬(Sonchus)植物，又名苦荬菜，苣荬菜等，是一種藥食同源的草本植物[1-2]。《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載其清熱涼血、消腫排膿、鎮(zhèn)咳祛痰、消食和胃、利尿[3]。在中國西部和華北民間多將苦菜作為時令野菜食用，并且認為可以有效地降低血糖、血壓、血脂[4-5]。據(jù)報道苦菜含有黃酮類、倍半萜內(nèi)酯、奎寧酸酯、甘油酸酯類等化學成分[6-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)苦菜中黃酮類成分多集中于其地上部分，且地上部分具有顯著的清除自由基等活性[9-11]。黃酮類化合物具有很好的降血糖，降血壓，調(diào)節(jié)血脂，抗氧化，抗腫瘤等功效[12-13]，現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究熱點。課題組依據(jù)前期研究推測苦菜黃酮類成分可能是其降血糖和抗氧化等作用的活性成分，建立了苦菜總黃酮含量的測定方法[11]，申報并授權苦菜的降血脂飲品，降血糖飲品，降血壓飲品等多項發(fā)明專利[14-16]。在此研究基礎上，該研究采用單因素實驗對大孔樹脂富集苦菜總黃酮的工藝參數(shù)進行研究，篩選最佳的工藝條件，為苦菜的降血糖，降血脂，降血壓等功能成分的深度開發(fā)提供研究基礎。

1 儀器，材料和試劑

TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用有限責任公司)； AL204 電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；旋轉蒸發(fā)儀 RE-52A (上海亞榮生化儀器廠)；KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

蘆丁標準品(由中國食品藥品檢定所提供，批號：100080 - 200306)；苣荬菜(采自陜西省榆林市米脂縣，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥生藥系張媛副教授鑒定為苣荬菜SonchusarvensisL.)；各種樹脂(滄州寶恩化工有限公司)； pH 試紙；乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 對照品和供試品溶液的制備方法

采用課題組前期建立的方法并已發(fā)表的文章[11]。

2.2 標準曲線的制作以及總黃酮含量的測定

精密量取濃度為0.246 6 mg/mL的蘆丁對照品溶液2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL于25 mL容量瓶中，分別補水至5.0 mL，加入5%NaNO2溶液3.0 mL，搖勻，靜置6 min。再加入10% Al(NO3)3溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min。最后加入4%NaOH溶液8 mL，加水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，在504 nm處測定吸光度值，設空白對照。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線，得到回歸方程為：A=0.954 6 C-0.008 8，r=0.999 6(n=6)，線性范圍為0.217 9～0.847 3 mg/mL。

2.3 總黃酮純度測定

精密稱取一定量的總黃酮粗提物，按照2.2于波長510 nm處測定吸光度，計算總黃酮的質(zhì)量分數(shù)。依法測定吸光度，測得苦菜地上部分總黃酮的質(zhì)量分數(shù)為1.61%。

式中：C為溶液中總黃酮的濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；M為粗提物的質(zhì)量(mg)；W為總黃酮質(zhì)量分數(shù)(%)。

2.4 大孔吸附樹脂的預處理

大孔樹脂是由有機單體和添加劑聚合而成的，本身存在有毒的有機殘留物，在使用之前應進行預處理，除去殘留的有毒物質(zhì)[17-19]。首先稱取九種型號的大孔樹脂適量于錐形瓶中，用去離子水沖洗除其雜質(zhì)，再用95%乙醇浸泡樹脂24h，使其充分溶脹，抽濾。將九種樹脂分別裝柱，乙醇沖洗，即至洗出液加水不混濁(取1mL乙醇洗出液加5mL水不混濁)為止。再以4%的稀鹽酸浸泡樹脂2h，以去離子水洗滌為中性，最后以2%的NaOH浸泡樹脂 2h，用去離子水洗滌為中性。過濾，備用。

2.5 大孔樹脂型號的篩選

精密稱取預處理過的九種型號的樹脂各3.0g，分別置于9個150mL具塞磨口三角瓶中，精密加入苦菜供試液(含總黃酮0.672 3mg/mL)30mL，密封，浸泡12h，每隔2h充分振搖1次，按照2.2的顯色方法測定吸附后各溶液中總黃酮含量，計算各種類型樹脂吸附率。取上述9種吸附后的樹脂，加入70%乙醇30mL，密封，浸泡12h，每隔2h充分振搖1次，測定各解吸液中總黃酮的量，計算70%乙醇解析率。

靜態(tài)吸附率=( C0-C1)/C0×100%

靜態(tài)解吸率=C2V2/( C0-C1)V0×100%

總黃酮回收率=靜態(tài)吸附率×靜態(tài)解吸率

試中：C0為供試液質(zhì)量濃度， C1為吸附后溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，C2為解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度，V0為供試液體積，V2為解吸液體積。

得出的結果如表1所示。

表1 9種不同型號大孔樹脂對總黃酮的靜態(tài)吸附性能

由表1數(shù)據(jù)，綜合比較9種極性不同的大孔樹脂，其中弱極性和非極性大孔吸附樹脂的吸附率和解析率均比較高，可能與苦菜中富含結構多樣的黃酮和黃酮苷類的極性不同有關[9]，造成樹脂對其黃酮類化合物吸附率和解析率影響因素復雜多樣。單從極性考慮的這九種樹脂的數(shù)據(jù)差異不是很顯著，但是相較而言ADS-7樹脂、AB-8樹脂、HPD-300樹脂三者的總黃酮吸附率比較高，其中AB-8樹脂的總黃酮解吸率達到92.07%，總黃酮回收率最高。故選用AB-8樹脂為富集苦菜地上部分總黃酮的最佳樹脂。

2.6 AB-8型大孔樹脂富集苦菜總黃酮的單因素考察

2.6.1 樣品溶液pH值的考察

取5 mL黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL的上樣溶液5份，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，取預處理過的AB-8樹脂40 g 進行濕法裝柱，控制吸附流速為2 mL/min，解吸附流速為2 mL/min，以70%乙醇洗脫至無色時依次測定洗脫液中總黃酮濃度，得到不同pH值下AB-8樹脂的總黃酮回收率。

圖1 pH值對總黃酮回收率的影響

結果如圖1所示，上樣液的pH值對苦菜地上部分總黃酮的回收率顯著影響較為顯著。pH值<5.0時，回收率隨著pH增大而增大；pH值=5.0時，回收率最大；pH值>5.0時，回收率隨著pH增大而減小?？嗖它S酮類化合物的酚羥基呈酸性，可能是在改變pH值時回收率不同的主要原因。pH值為3.0、4.0時，溶液的酸性過強易于析出沉淀，同時黃酮苷類成分的苷鍵的容易水解，導致回收率下降；因此，試驗確定最佳上樣溶液pH值為5.0左右。

2.6.2 上樣濃度的考察

分別配置濃度為0.336 2 mg/mL、0.490 6 mg/mL、0.672 3 mg/mL、0.832 3 mg/mL、1.008 5 mg/mL的溶液，各量取5 mL，均調(diào)節(jié)pH值為5.0進行上樣，控制吸附流速為2 mL/min，解吸流速為3 mL/min，用70%乙醇洗脫，至無色，依次測定洗脫液的總黃酮濃度。

圖2 上樣濃度對總黃酮回收率的影響

結果見圖2，在0.336 2～0.672 3 mg/mL范圍內(nèi)隨著上樣液濃度增大，總黃酮回收率呈現(xiàn)升高趨勢。在0.672 3～1.008 5 mg/mL范圍內(nèi)隨著上樣液濃度增大，總黃酮回收率呈現(xiàn)降低趨勢。原因可能是隨著上樣液濃度增加，AB-8樹脂達到飽和時吸附力減弱，并且濃度過大容易堵塞樹脂，因此回收率出現(xiàn)先增大后降低趨勢。綜上考慮，最佳上樣濃度選擇0.672 3 mg/mL。

2.6.3 吸附流速考察

取5 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL的樣品溶液4份，調(diào)節(jié) 4 份樣品溶液的pH值為5.0，分別裝入預處理過的AB-8型大孔樹脂柱中，控制4根樹脂柱的樣品溶液吸附流速分別為1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min、4 mL/min，解吸附流速均為2 mL/min，以70%乙醇進行洗脫，計算得到不同吸附流速下的總黃酮回收率。

圖3 吸附流速對總黃酮回收率的影響

結果如圖3所示。由圖可知，吸附流速為1～3 mL/min時回收率差異不大；吸附流速為3～4 mL/min時回收率隨吸附流速的增加而急劇降低。上樣液流速慢有利于樹脂對于黃酮類化合物的吸附，但考慮到吸附效果和工作效率，故選擇2 mL/min為最佳吸附流速。

2.6.4 解吸流速的考察

取5 mL黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL的樣品溶液4份，調(diào)節(jié)4份樣品溶液的pH值為5.0，濕法裝柱，控制4根樹脂柱的樣品溶液吸附流速均為2 mL/min，分別控制解吸流速為1 mL/min、2 mL/min、3 mL/min、4 mL/min，以70%乙醇洗脫，至無色，測定洗脫液中的總黃酮濃度，計算得到總黃酮回收率。

圖4 解吸速率對總黃酮回收率的影響

結果由圖4可以看出，隨著解吸流速的增加，回收率呈增加趨勢，在3 mL/min時出現(xiàn)最大，但增加到4 mL/min時回收率呈下降趨勢，故確定本工藝的最佳洗脫流速為3 mL/min。

2.6.5 洗脫液濃度的考察

取5 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL的樣品溶液5份，調(diào)節(jié)5份樣品溶液的pH值為5.0，進行濕法裝柱，控制5根樹脂柱的樣品溶液吸附流速均為2 mL/min，控制五根樹脂柱的洗脫速率均為3 mL/min，分別以濃度為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液進行洗脫，至洗脫液無色，分別測定洗脫液中總黃酮濃度，計算其總黃酮回收率。

圖5 洗脫液濃度對總黃酮回收率的影響

由圖5可知，洗脫液濃度在10%～70%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮的回收率呈上升趨勢，當乙醇濃度達到70%時，總黃酮的回收率達到最大值，當乙醇濃度繼續(xù)增加時，總黃酮的回收率略微呈現(xiàn)下降的趨勢。洗脫液的極性問題，是造成回收率不同的主要原因，極性多大或者過小時，大部分黃酮類成分洗脫不下來，因此出現(xiàn)隨著乙醇濃度增加，回收率先增加后減弱。本工藝選擇70%乙醇為最佳洗脫濃度。

2.6.6 洗脫體積的考察

量取5 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL的樣品溶液5份，分別調(diào)節(jié)5份樣品溶液的pH值為5.0，進行濕法裝柱，控制五根樹脂柱中樣品的吸附流速均為2 mL/min，分別以柱體積分別為1 BV、1.5 BV、2 BV、2.5 BV、3 BV的70%乙醇溶液進行洗脫，控制洗脫流速均為3 mL/min，分別測定5份洗脫液的總黃酮濃度，計算總黃酮回收率。

圖6 洗脫體積對總黃酮回收率的影響

如圖6可知，在一定范圍內(nèi)，流出液中總黃酮回收率隨著洗脫液體積的增加而增加，當洗脫體積為2 BV時，洗脫液中總黃酮回收率基本達到最大值，繼續(xù)增加洗脫液體積意義不大，故選擇2 BV為最佳洗脫體積。

2.6.7 樹脂柱徑高比的考察

取5.0 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL的樣品溶液5份，調(diào)節(jié)5份樣品溶液的pH值均為5.0，進行濕法裝柱，控制五根樹脂柱中樣品的吸附流速為2 mL/min，均用2 BV 70%乙醇溶液以3 mL/min的流速進行洗脫，依法測定5份洗脫液中總黃酮濃度，分別計算總黃酮回收率。

圖7 樹脂徑高比對總黃酮回收率的影響

結果如圖7可知，樹脂柱徑高比為1∶5、1∶7、1∶10時，總黃酮回收率差別不明顯。在實際應用中徑高比1∶10的使用相對較多，故優(yōu)選1∶10作為樹脂的最佳柱徑高比。

2.6.8 樹脂使用次數(shù)的考察

按照上述優(yōu)化的吸附條件和解吸條件，量取5 mL供試品溶液進行過柱，在同一根樹脂柱上重復操作5次，分別測定5份洗脫液的總黃酮濃度，計算總黃酮回收率。

圖8 樹脂使用次數(shù)對總黃酮回收率的影響

結果如圖8所示，樹脂在使用3次之后對黃酮的吸附能力明顯下降，所以可確定AB-8型大孔樹脂在分離純化苦菜地上部分總黃酮時最多使用3次。

2.6.9 總黃酮吸附泄露曲線

取供試品溶液150 mL加入已預處理好的AB-8樹脂進行動態(tài)吸附。控制吸附速率為2 mL/min，每10 mL收集一次流分，以總流分體積為橫坐標，各個流分中總黃酮濃度為縱坐標，繪制吸附泄露曲線。

圖9 泄露曲線

結果如圖9，由該曲線可見，上樣體積達到70 mL時，開始出現(xiàn)明顯泄露，此時樹脂的動態(tài)吸附量為0.588 3 mg/g。

2.6.10 吸附動力學曲線

準確稱取AB-8樹脂3.0 g，加入樣液30 mL，于具塞磨口三角瓶中，振搖吸附，每隔5 min取一次溶液測定吸光度，以時間為橫坐標、總黃酮成分的吸附率縱坐標，繪制AB-8樹脂對苦菜總黃酮的吸附動力學曲線。

圖10 吸附動力學曲線

結果如圖10所示，吸附時間達到40 min時，吸附率由增長趨勢基本轉為平穩(wěn)，40 min后所測定的吸附率并無明顯增加。由該曲線確定AB-8樹脂對苦菜總黃酮的吸附達到平衡的臨界時間為40 min。

2.7 最優(yōu)工藝的驗證

按照上述最優(yōu)條件，選取3根AB-8樹脂柱同時進行苦菜總黃酮富集純化試驗，實驗結果測得總黃酮回收率分別為82.49%、83.07%、82.73%，平均總回收率為82.76%。且洗脫液中總黃酮的質(zhì)量分數(shù)分別為3.94%、3.87%、3.92%，平均質(zhì)量分數(shù)為3.91%，純化倍數(shù)2倍。可見，AB-8型大孔樹脂對苦菜地上部分總黃酮成分進行有效的富集，且重復性較好。

3 結論與討論

本論文與已有文獻比較[20]，不同之處在于對苦菜地上部分總黃酮類進行富集，增加了總黃酮回收率指標，客觀的說明大孔吸附樹脂純化苦菜地上部分總黃酮方法的可行性和科學性，同時考察了九種不同極性大孔吸附樹脂對總黃酮的富集優(yōu)化工藝，通過靜態(tài)吸附和解吸附實驗確定弱極性的AB-8樹脂的回收率達到78.03%，是富集純化苦菜地上部分總黃酮的最佳樹脂。該工藝優(yōu)化最終選用吸附率、解析率、回收率較高且價格低且易于獲得的AB-8樹脂，并優(yōu)化其工藝參數(shù)。最佳工藝參數(shù)：最佳上樣pH值為5.0；乙醇洗脫液的濃度為70%，且洗脫體積為2BV；最佳吸附流速為2 mL/min；最佳解吸流速為3 mL/min；最佳上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為0.672 3 mg/mL，樹脂柱最優(yōu)徑高比為10∶1，樹脂最多重復使用3次，純化倍數(shù)為2.43。該工藝對苦菜地上部分的總黃酮成分進行了有效的富集，為富含苦菜黃酮類成分苦菜的降血糖、降血脂、降血壓產(chǎn)品開發(fā)提供原料奠定基礎。

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Enriching Technic-process of Total Flavonoids from the Aerial- part of Sonchus Arvensis L.

LIU Dong-han, WANG Yan, TIAN Yu-xin, BAI Shao-juan, CHEN Xiao-yi, ZHAO Yi-cheng,ZHOU Yang, HE Ting, SHE Gai-mei

(SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Filter the best macroporous resin and establish purification technology of total flavonoids from the aerial part of Sonchus arvensis L. with the recovery index of total flavonoids as the reference. The best macroporous resin was filtered among the nine resins by investigating the static adsorption and desorption properties through experiments, and then optimize the separation process of total flavonoids from the aerial part of Sonchus arvensis L. by using the best resin. The results showed that the AB-8 macroporous resin had good adsorption and desorption. The optimal technological conditions were: pH=5.0, initial concentration 0.672 3 mg/mL, flow rate of adsorption 2 mL/min, 2BV , 70% ethanol, and desorption flow rate 3 mL/min.The diameter height ratio of resin column was 1∶10 and the macroporous resin could be used under 3 times. Under this condition, the purity of total flavonoids had been increased from 1.61% to 3.91%. The AB-8 macroporous resin could be used to purify the total flavonoids from the aerial part of Sonchus arvensis L.

Macroporous resin; Sonchus arvensis L.; Total flavonoids

2016-05-19

2016-06-20

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201510026050)

劉冬涵(1996-)，女，本科大學生，專業(yè)：中藥學。

*通訊作者：折改梅(1976-),女，博士，研究員，博士生導師，研究方向：中藥(民族藥)藥效成分和新藥創(chuàng)制研究。

R284.2

A

1002-2392(2017)02-0094-05