劉斌，劉國良，張寧，張紅，張濤*，董曉紅，周忠光

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡保護(hù)作用

劉斌1，劉國良1，張寧1，張紅2，張濤2*，董曉紅1，周忠光1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)的大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVEC)凋亡的影響。方法：建立Aβ?lián)p傷大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，不同濃度(0.1、1、10 μg/ml)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)，MTT法檢測大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力；western-blot法檢測大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞中凋亡蛋白bax和caspase9表達(dá)水平。結(jié)果：補(bǔ)陽還五湯在濃度(0.1、1、10 μg/ml)能夠抑制Aβ誘導(dǎo)的大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞bax和caspase9蛋白的表達(dá)并呈濃度依賴性。結(jié)論：補(bǔ)陽還五湯能夠通過抑制凋亡蛋白bax和caspase9的表達(dá)而具有保護(hù)大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，可能成為是一種有效的抗腦血管系統(tǒng)疾病治療劑。

補(bǔ)陽還五湯；bax；caspase9；大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又稱老年癡呆，是一種以記憶逐步減退和進(jìn)行性認(rèn)知障礙為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。AD的主要病理特征為神經(jīng)元丟失、老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積[1-4]。近十多年來的研究表明,微血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelial cell,VEC)是一種具有廣泛生物活性的細(xì)胞,它通過合成、分泌多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管的通透性。微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠限制可溶性物質(zhì)從血液進(jìn)入大腦，是血腦屏障的主要組成部分，當(dāng)VEC功能受損時(shí),其功能失調(diào),通透性改變,從而引起相關(guān)疾病的發(fā)生[5]。

中醫(yī)認(rèn)為AD屬于“絡(luò)病”范疇，補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、桃仁、川芎、紅花、地龍組成，諸藥合用，共奏補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)陽還五湯具有改善腦血循環(huán)和微循環(huán)[6]，促進(jìn)血管新生[7]、抗細(xì)胞凋亡[8-9]，對(duì)抗興奮性氨基酸[10-11]等藥理作用。補(bǔ)陽還五湯以往多用于治療缺血性腦血管疾病[12-13],但其與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用關(guān)系如何，補(bǔ)陽還五湯是否可以通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡來達(dá)到抗老年癡呆的效果目前尚不清楚，特別是與凋亡因子bax和caspase9關(guān)系如何尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以補(bǔ)陽還五湯作用于大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，考察補(bǔ)陽還五湯對(duì)凋亡因子bax和caspase9表達(dá)的影響，探討Caspase-9和Bax在AD發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)陽還五湯(BYHWD)粉劑制備

BYHWD由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心田明教授制備成干粉，4℃冰箱中保存。

1.2 大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMVEC)常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、雙抗各1×105U/L的DMEM培養(yǎng)液中，置細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)，于37℃恒溫、5% CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Aβ25-35誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷構(gòu)建

將凍干粉5 mgAβ25-35溶解于33.3 mL滅菌水配制成150 μmol/L的儲(chǔ)備液，過濾后37 ℃恒溫孵育7天，-20 ℃保存。將Aβ25-35分成6個(gè)濃度組：0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L。取細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×103～1×104個(gè)/mL，接種于96孔板，100 μL每孔，8孔每組，細(xì)胞接種24 h后基本貼壁用移液槍吸盡個(gè)空中的完全培養(yǎng)液，按照分組每孔分別加入180 μL事先配制的不同濃度的Aβ25-35溶液，一次接種3塊96孔板，分別在換液后24 h，48 h，72 h進(jìn)行OD值的檢測。

1.4 MTT法細(xì)胞活力分析

選取無菌96孔板，96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入5×103～1×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，每孔加入180 μL培養(yǎng)液，CO2孵箱中培養(yǎng)24 h并且加入倍比稀釋成3種濃度的BYHWD(0.1 mg/L,1 mg/mL,10 mg/mL)各180 μL，孵箱中培養(yǎng)68 h后吸去上清液，每孔中加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，自動(dòng)酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度值(A值)。

1.5 bax和caspase9蛋白含量測定

補(bǔ)陽還五湯(0.1、1、10 μg/ml) 加入Aβ誘導(dǎo)的大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)68 h后，收集細(xì)胞，用 Western blot 測定細(xì)胞中bax和caspase9蛋白的表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用三次實(shí)驗(yàn)平均值±SD計(jì)算。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析使用方差分析，P<0.05差異認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Aβ劑量確定

如表1所示，小于1 nmol/L的Aβ基本不影響大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力，大于10 nmol/L的Aβ明顯抑制細(xì)胞活性。說明自10 nmol開始對(duì)大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，并且隨著劑量的增大細(xì)胞活力降低，所以我們選擇10 nmol/L Aβ為造模濃度。

表1 相對(duì)細(xì)胞抑制率百分比結(jié)果±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)PMVEC細(xì)胞bax蛋白表達(dá)的影響

由圖1，2可知，Aβ誘導(dǎo)顯著上調(diào)bax蛋白表達(dá)，補(bǔ)陽還五湯高中低劑量(10 mg/L,1 mg/mL,0.1 mg/mL)預(yù)處理，三個(gè)濃度對(duì)bax表達(dá)均有顯著逆轉(zhuǎn)作用，均有顯著性差異(P<0.01)。

圖1 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)PMVEC細(xì)胞bax蛋白表達(dá)的影響

圖2 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)PMVEC細(xì)胞bax蛋白表達(dá)的影響注：與空白組相比，#P<0.01;與UVB模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)PMVEC細(xì)胞casepase9蛋白表達(dá)的影響

由圖3，4可知，Aβ誘導(dǎo)顯著上調(diào)casepase9蛋白表達(dá)，濃度補(bǔ)陽還五湯高中低劑量(10 mg/L,1 mg/mL,0.1 mg/mL)預(yù)處理，三個(gè)濃度對(duì)casepase9表達(dá)均有顯著逆轉(zhuǎn)作用，均有顯著性差異(P<0.01)。

圖3 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)PMVEC細(xì)胞casepase9蛋白表達(dá)的影響

圖4 補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ誘導(dǎo)PMVEC細(xì)胞casepase9蛋白表達(dá)的影響注：與空白組相比，#P<0.01;與UVB模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

Aβ是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，但當(dāng)其細(xì)胞外濃度過高時(shí)，可產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，造成神經(jīng)元的損傷。前期我們以“β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說”為切入點(diǎn)，采用大鼠單側(cè)海馬區(qū)定向注射Aβ1-40復(fù)制AD動(dòng)物模型，探討補(bǔ)陽還五湯對(duì)AD模型大鼠的作用及相關(guān)機(jī)制。研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯對(duì)Aβ1-40所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯改善作用[14-16]；可顯著地降低AD模型大鼠海馬和皮質(zhì)Aβ沉積，改善Aβ所造成的神經(jīng)元和微血管損害，減輕腦組織炎性反應(yīng)；并且可以影響免疫炎性細(xì)胞因子及相關(guān)基因的表達(dá)[15-17]。然而補(bǔ)陽還五湯抗AD的分子調(diào)控機(jī)制仍有待于深入研究。

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是基因調(diào)控的自主、有序的死亡過程[18]。目前人們已認(rèn)識(shí)到很多疾病的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡分子機(jī)制中重要的一條途徑為內(nèi)源性途徑， Caspase-9位于此途徑級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，是凋亡途徑中重要起始因子[19]。本研究結(jié)果顯示，Caspase-9 在Aβ25-35誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷表達(dá)量明顯高于正常組，引起細(xì)胞凋亡，而補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后Caspase-9蛋白表達(dá)量降低，說明補(bǔ)陽還五湯具有抑制細(xì)胞凋亡作用。

Bax是Bcl-2基因家族中細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因[20-21]。本研究結(jié)果顯示，Bax在Aβ造模的大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞中的表達(dá)量(P<0.05)，提示在微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的老年癡呆發(fā)生過程中可能有促凋亡基因 Bax 的參與，補(bǔ)陽還五湯作用大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞后Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，表明補(bǔ)陽還五湯可有效抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)的作用。

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Protective Effects of Buyang Huanwu Decoction on Apoptosis ofMicrovascular Endothelial Cells Induced by Aβ in Rats

LIU Bin1,LIU Guo-liang1,ZHANG Ning1,ZHANG Hong2,ZHANG Tao2,DONG Xiao-hong1,ZHOU Zhong-guang1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China；2.JiamusiUniversity，Jiamusi154007，China)

Objective：To investigate the influence of Buyang Huanwu decoction on apoptosis of microvascular endothelial cells induced by Aβin rats. Methods: Establish the damage models of microvascular endothelial cells induced by Aβ and different concentrations of Buyang Huanwu decoction (0.1, 1, 10 ug/ml) were given. Methylthiazolyl tetrazolium (MTT) assay was adopted to measure the viability of microvascular endothelial cells. Western blot method was used to determine the expression of bax and caspase-9 proteins. Results: The expression of bax and caspase-9 proteins of microvascular endothelial cells induced by Aβ were inhibited by Buyang Huanwu decoction (0.1, 1, 10 ug/ml) in a concentration-dependent manner. Conclusion: Buyang Huanwu decoction can inhibit the expression of bax and caspase-9 proteins and it has a protective effect on microvascular endothelial cells in rats, which may be an effective therapeutic agent for cardiovascular system diseases.

Buyang Huanwu decoction; Bax；Caspase9；Microvascular endothelial cells in rats

2016-10-12

2016-12-10

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541758)

劉斌(1970-)，男，副教授，博士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治老年性癡呆及其抗腫瘤的研究工作。

*通訊作者：張濤(1971-)，女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事腫瘤免疫機(jī)制及中藥抗腫瘤研究。

R285.5;R289.56

A

1002-2392(2017)02-0077-03