楊紹杰，紀(jì)銳，孫佳寶，陳光偉，黃樹明，楊書彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

方 劑 研 究

左歸飲對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型大鼠肝腎功能及其自由基代謝的影響

楊紹杰，紀(jì)銳，孫佳寶，陳光偉，黃樹明，楊書彬*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究滋陰補(bǔ)腎方左歸飲對(duì)D-半乳糖致亞急性衰老模型大鼠肝腎功能及自由基代謝水平的影響，初步探索其抗衰老作用機(jī)制。方法：取健康SD大鼠72只，雌雄各半，隨機(jī)分為六組，即對(duì)照組，模型組，維生素E組，左歸飲高、低劑量組及六味地黃丸組。除對(duì)照組頸背部皮下注射生理鹽水外，其余各組頸背部皮下分別連續(xù)注射D-半乳糖造成亞急性衰老模型。造模同時(shí)，各給藥組分別灌胃給予維生素E、高、低劑量左歸飲及六味地黃丸藥液進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組與模型組同時(shí)分別給予等體積的蒸餾水。連續(xù)給藥8周后，腹主動(dòng)脈采血，取大鼠肝、腎組織，測(cè)定血清中肝腎功能主要指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)，以及肝腎組織中超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)水平。結(jié)果：與模型組比較，左歸飲給藥組能夠降低大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN的含量，提高大鼠肝、腎組織中SOD 和T-AOC的活性，降低MDA的含量。結(jié)論：左歸飲可能通過改善衰老大鼠的肝腎功能，影響肝腎自由基代謝水平而起到延緩衰老的作用。

左歸飲；抗衰老；肝腎功能

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，衰老源于自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，體內(nèi)自由基會(huì)剝奪細(xì)胞內(nèi)分子外圍的電子，為其未成對(duì)電子配對(duì)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，被剝奪電子的分子變成新的自由基，并繼續(xù)剝奪其他分子的電子，發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對(duì)包含該分子的細(xì)胞產(chǎn)生損害[1]。中醫(yī)認(rèn)為衰老與肝腎有關(guān)，“肝腎同源”即表達(dá)肝中所藏之血與腎中所藏之精可相互轉(zhuǎn)化，肝血充盈則腎精足，腎精充沛則肝血旺，若肝血不足可致腎虛，反之亦然，肝腎虧虛表現(xiàn)出來的發(fā)墮齒落，爪甲無光，筋不能動(dòng)，目始不明，正是衰老的一系列體征[2]。左歸飲為《景岳全書》中記載的滋陰補(bǔ)腎名方，方中藥物有熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、茯苓和炙甘草，中醫(yī)常用以治療腰酸遺泄，盜汗，口燥咽干等真陰不足證[3]，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，左歸飲具有延緩衰老作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖復(fù)制大鼠衰老模型，同時(shí)采用左歸飲進(jìn)行干預(yù)治療，觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的肝腎功能及自由基代謝水平的影響，試圖闡明左歸飲保護(hù)肝腎的抗衰老作用機(jī)制，進(jìn)而為中醫(yī)藥延緩衰老機(jī)制的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12月齡健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。

1.2 藥物與試劑

熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、茯苓和炙甘草(均購于安國市弘發(fā)中藥材飲片有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)楊書彬副教授鑒定為正品)；六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)；D-半乳糖(Sigma公司)；維生素E(青島雙鯨藥業(yè)有限公司)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司)；SOD、MDA、T-AOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ALT、AST、ALP、BUN、CREA試劑盒(北京利德曼生化股份有限公司)。

1.3 儀器

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；ME155DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);L600型臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);全自動(dòng)生化分析儀(日立公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

按左歸飲處方比例稱量藥材，以10倍量蒸餾水浸泡，時(shí)間30 min，煎煮至沸騰，并保持微沸40 min，8層紗布過濾，得濾液；再以8倍量蒸餾水煎煮至沸，并保持微沸20 min，依上法過濾，與前次所得濾液合并，濃縮至含生藥量0.1 g/mL，凍干得粉，備用。六味地黃丸以蒸餾水研磨，得0.04 g/mL藥液。D-半乳糖以生理鹽水溶成50 mg/mL注射用藥。

2.2 模型建立及給藥

取健康SD大鼠72只，雌雄均半，隨機(jī)分六組，即對(duì)照組，模型組，給藥組(維生素E組，左歸飲高、低劑量組，六味地黃丸組)。除對(duì)照組頸背部皮下注射生理鹽水外，其余各組頸背部皮下注射D-半乳糖復(fù)制亞急性衰老模型，劑量為125 mg/(kg·d)。造模同時(shí)，各組灌胃給藥，維生素E組給予維生素E 10 mg/(kg·d)，左歸飲高、低劑量組分別給予左歸飲藥液2.4 g/(kg·d)和1.2 g/(kg·d)，六味地黃丸組給予六味地黃丸藥液0.4 g/(kg·d)，對(duì)照組與模型組給予蒸餾水，連續(xù)8周。

2.3 取材及處理

末次給藥24 h后，根據(jù)大鼠體質(zhì)量，以10%水合氯醛腹腔注射將其完全麻醉，腹主動(dòng)脈采集血液，室溫下放置2 h，3 000 r/min離心，時(shí)間10 min，收集離心所得血清，用于肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)；取肝、腎組織，于冰冷生理鹽水中漂洗去組織表面血液，濾紙吸干，稱重，加入適量生理鹽水，在冰水浴中機(jī)械勻漿，最終制得10%肝、腎組織勻漿，將制備好的組織勻漿在2 000 r/min條件下離心15 min，取上清勻漿液，用于自由基代謝指標(biāo)檢測(cè)。

2.4 指標(biāo)測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血清進(jìn)行ALT、AST、ALP、CREA及BUN各指標(biāo)檢測(cè)；按照試劑盒說明書要求，對(duì)肝、腎組織勻漿中的SOD、T-AOC及MDA各指標(biāo)水平進(jìn)行測(cè)定。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN的影響

結(jié)果見表1。與對(duì)照組比較，模型組除ALT略有降低外，其余各項(xiàng)指標(biāo)水平均有明顯增加，其中ALP、BUN、CREA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，各給藥組對(duì)所有指標(biāo)水平均有回調(diào)趨勢(shì)，其中各給藥組中BUN，維生素E組及左歸飲低劑量組中AST，維生素E組、左歸飲高劑量組及六味地黃丸組中ALP和CREA，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 對(duì)大鼠血清中ALT、AST、ALP、CREA及BUN的影響

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與對(duì)照組比較，△P<0.05,△△P<0.01

3.2 對(duì)大鼠肝組織中SOD、T-AOC及MDA的影響

結(jié)果見表2。與對(duì)照組比較，模型組肝臟組織SOD 和T-AOC活性顯著降低，MDA含量顯著升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，各給藥組肝臟組織SOD 和T-AOC活性顯著升高，MDA含量顯著降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 對(duì)大鼠腎臟組織中SOD、T-AOC及MDA的影響

表2 對(duì)大鼠肝組織中SOD、MDA及T-AOC的影響

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與對(duì)照組比較，△P<0.05,△△P<0.01

結(jié)果見表3。與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟組織中SOD 和T-AOC的活性顯著降低，MDA含量顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，各給藥組大鼠腎臟組織中SOD 和T-AOC的活性均顯著升高，MDA的含量明顯降低， 除左歸飲低劑量組MDA的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 對(duì)大鼠腎組織中SOD、MDA及T-AOC的影響

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與對(duì)照組比較，△P<0.05,△△P<0.01

4 討論

研究表明，衰老小鼠的肝腎會(huì)出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)退行性病變，組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的不同程度損傷[6-7]。當(dāng)肝腎組織出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)的退行性病變時(shí)，其代謝水平和生理功能都會(huì)受到一定程度的影響。ALT、AST、ALP、BUN及CREA是評(píng)價(jià)肝腎臟功能的重要指標(biāo)，當(dāng)肝腎組織出現(xiàn)損傷或者病變時(shí)，其對(duì)應(yīng)的功能指標(biāo)水平也將出現(xiàn)不同程度的變化[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，左歸飲對(duì)衰老大鼠肝腎功能指標(biāo)水平均有回調(diào)作用，尤其對(duì)BUN、AST、ALP和CREA指標(biāo)作用明顯，說明左歸飲具有改善肝腎功能的作用。在衰老的幾大學(xué)說中，學(xué)者們普遍認(rèn)可的是1956年Harman D提出的自由基學(xué)說，該學(xué)說指出，正常情況下，機(jī)體內(nèi)的自由基可被抗氧化酶類清除，不對(duì)細(xì)胞造成損傷。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶類減少或活性降低時(shí)，體內(nèi)的自由基數(shù)量增加，此時(shí)過多的自由基就會(huì)造成體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)及脂類的損傷，影響機(jī)體正常功能，從而導(dǎo)致衰老[6]。SOD是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，能夠清除多余的超氧陰離子自由基[7-9]，T-AOC是體內(nèi)多種抗氧化物抗氧化能力的總和，MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物[10]，三者均為現(xiàn)代研究抗氧化和抗衰老重要檢測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，左歸飲通過升高大鼠肝腎組織中SOD、T-AOC活性水平，降低MDA含量的作用，發(fā)揮延緩衰老作用。中醫(yī)理論認(rèn)為，人的衰老跟五臟的虛衰有著緊密聯(lián)系，《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載：“五十歲，肝氣始衰，肝葉始薄，膽汁始滅，目始不明；六十歲，心氣始衰，苦憂悲，血?dú)庑笁?，故好臥；七十歲，脾氣虛，皮膚枯；八十歲，肺氣衰，魄離，故言善誤；九十歲，腎氣焦，四臟經(jīng)脈空虛；百歲，五臟皆虛，神氣皆去，形骸獨(dú)居而終矣?！盵11]可見，人之衰老，始于五臟，五臟虛衰，以肝為先[12]，至腎而終。中醫(yī)又有“肝腎同源”的重要理論。因此，中藥抗衰老可從補(bǔ)益肝腎的途徑，絕肝氣始衰，延腎氣之壽。左歸飲方中重用熟地黃，滋腎填陰，山茱萸、枸杞子輔之養(yǎng)肝血，茯苓、炙甘草佐之益氣健脾，山藥益陰健脾滋腎，諸藥合用有滋腎養(yǎng)肝益脾功效[13]。

綜上所述，左歸飲可以通過改善衰老大鼠肝腎功能，提高肝腎組織自由基代謝水平，發(fā)揮抗衰老作用，也為其抗衰老作用及機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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2016-12-19

2017-01-15

黑龍江省科技廳面上項(xiàng)目(LC2008C26)

楊紹杰(1991-)，男，碩士研究生，主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及活性研究工作。

*通訊作者：楊書彬(1970-)，男，博士，副教授,碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)及活性研究工作。

R285.5;R289.51

A

1002-2392(2017)02-0074-03