李金龍 鄧 歡 劉金艷 毛俊霞 王 瑤 唐志如

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，生物飼料與分子營養(yǎng)室驗室，重慶400715)

益生菌大腸桿菌Nissle 1917抗逆性能、豬腸上皮細胞黏附率及抑菌效果研究

李金龍 鄧 歡 劉金艷 毛俊霞 王 瑤 唐志如*

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，生物飼料與分子營養(yǎng)室驗室，重慶400715)

本試驗旨在研究益生菌大腸桿菌Nissle 1917(EcN)抗逆性能、豬腸上皮細胞黏附率及抑菌效果。采用體外法對EcN進行生長曲線繪制和耐酸、耐膽鹽、耐熱性能的測定；以豬腸上皮細胞IPEC-J2細胞為體外細胞模型，考察了EcN對該細胞的黏附率以及對致病菌大腸桿菌K88的黏附抑制率；同時通過蛋白質(zhì)印跡法檢測了EcN對IPEC-J2細胞β-防御素-2和Toll樣受體4的水平的影響。結(jié)果表明：1)EcN對高酸、高膽鹽和高溫環(huán)境具有一定耐受能力。2)EcN對IPEC-J2細胞的黏附作用以對數(shù)期最佳，黏附率達33.96%，顯著高于遲緩期、穩(wěn)定期和衰亡期(P<0.05)。3)EcN對致病菌大腸桿菌K88具有良好的抑制效果，黏附抑制率達87.84%。4)EcN還能上調(diào)IPEC-J2細胞β-防御素-2和Toll樣受體4水平。結(jié)果提示，益生菌EcN具有較好的抗逆性能，能夠良好地黏附豬腸上皮細胞，對致病菌大腸桿菌K88具有良好的抑制作用。

大腸桿菌Nissle 1917；豬腸上皮細胞；IPEC-J2細胞；黏附性能；抗逆性能；耐熱性能；抑菌效果

大腸桿菌Nissle 1917(EcN)(血清型為O6∶K5∶H1)是一株被德國醫(yī)生Alfred Nissle在一戰(zhàn)期間發(fā)現(xiàn)并分離得到的無致病性的革蘭氏陰性益生菌[1]。EcN的益生功能與其對腸道微生物的調(diào)控和腸道內(nèi)細胞因子引起免疫反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)[2]。EcN通過調(diào)控抗菌肽的表達，增加免疫球蛋白A(IgA)和黏蛋白的分泌以及促進抗炎癥免疫反應(yīng)[3]，在腸道中發(fā)揮重要的免疫功能。EcN也能通過上調(diào)緊密連接蛋白閉鎖小帶的表達以及促進緊密連接蛋白上調(diào)和再分布[4-5]，對增強豬腸上皮細胞的緊密連接和提高黏膜屏障具有重要的作用?？诜﨓cN能顯著降低斷奶仔腹豬瀉率和競爭性阻礙沙門氏菌入侵[6]，也能有效預(yù)防產(chǎn)毒素大腸桿菌的感染[7]。由此可見，EcN對提高動物腸道免疫功能、保護腸道屏障具有重要的作用。益生菌在腸道內(nèi)存活并黏附于腸道上皮細胞表面，是其發(fā)揮益生作用的前提和基礎(chǔ)。因此，本試驗旨在探明EcN的生長特性，耐酸、耐膽鹽和耐熱的性能，對豬腸上皮細胞黏附性能，以及對致病菌的抑菌效果，為EcN在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 EcN生長曲線的測定和菌液制備

EcN菌株購自德國微生物菌種中心(編號為DSM 6601)。大腸桿菌K88菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察。采用比濁法繪制EcN和大腸桿菌K88生長曲線，以培養(yǎng)時間(0～30 h)為橫坐標，以對應(yīng)的通過測定LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的600 nm吸光度值(OD600 nm)， OD600 nm為縱坐標繪出EcN的生長曲線。采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)EcN和大腸桿菌K88菌液，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)將菌液調(diào)整濃度約為1.0×108CFU/mL，用于體外抗逆性能、豬腸上皮細胞黏附性能和抑菌效果檢測。

1.2 IPEC-J2細胞的培養(yǎng)

豬空腸上皮細胞IPEC-J2細胞來自西南大學(xué)動物科技學(xué)院實驗室的凍存細胞。將復(fù)蘇細胞置于培養(yǎng)瓶中，加入5 mL DMEM完全細胞培養(yǎng)液(含5%胎牛血清+1%雙抗)，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待貼壁率達85%時，胰酶消化，調(diào)整濃度約為2.0×105個/mL，置于六孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，生長至單層后進行后續(xù)試驗。

1.3 體外抗逆性能檢測

1.3.1 耐酸和耐膽鹽

取等體積EcN菌液分別置于pH 1.5、2.0和2.5的模擬胃液中，以pH 7.0模擬胃液為對照。再取等體積EcN菌液分別置于豬膽鹽濃度為0、0.30%、0.60%和0.90%的LB液體培養(yǎng)基中，每組3個重復(fù)。胃酸組和膽鹽組置于37 ℃ 200 r/min恒溫振蕩器中分別培養(yǎng)3和24 h。處理后與處理前細菌總數(shù)比值的百分數(shù)為EcN存活率。

1.3.2 耐熱

取4份9 mL滅菌生理鹽水于試管中并預(yù)熱至80 ℃，再分別加入1 mL菌液，保溫30、40、50和60 s后，迅速冷卻，對不同保溫時間組菌液按10倍梯度進行稀釋，吸取100 μL最佳稀釋濃度菌液均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后菌落計數(shù)，每組2個重復(fù)。調(diào)節(jié)水溫至70、65 ℃，重復(fù)上述試驗，用1.3.1中的計算方法計算EcN存活率。

1.4 IPEC-J2細胞黏附和抑菌試驗

試驗組取2 mL DMEM不完全細胞培養(yǎng)液(不含雙抗)和1 mL各時期(遲緩、對數(shù)、平穩(wěn)和衰亡期)EcN菌液加入IPEC-J2細胞，以等體積無菌PBS替代EcN菌液作為對照組，每組重復(fù)3孔，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)2 h后，PBS漂洗5次，自然晾干，甲醇固定20 min，革蘭氏染色，油鏡下隨機選取25個視野，拍照和計數(shù)100個細胞上黏附的EcN菌數(shù)，細胞黏附細菌數(shù)與加入細菌總數(shù)比值的百分數(shù)為EcN黏附率。

試驗組取EcN菌液500 μL與IPEC-J2細胞預(yù)先培養(yǎng)2 h后，再加入大腸桿菌K88菌液500 μL和1 mL DMEM不完全細胞培養(yǎng)液，以未加EcN的大腸桿菌K88菌液作為對照組。37 ℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，PBS漂洗5次，裂解細胞并10倍梯度稀釋裂解液，再均勻涂抹于選擇性培養(yǎng)基紫紅膽汁瓊脂(VRBA)上，平板計數(shù)。每組重復(fù)4孔，取平均值。按以下公式計算EcN對致病菌的黏附抑制率：

黏附抑制率(%)=100×(對照組-

試驗組)/對照組。

取100 μL大腸桿菌K88菌液均勻涂抹于瓊脂培養(yǎng)基上，于無菌超凈臺上室溫晾干，再用牛津杯(直徑為8 mm)進行打孔。取200 μL EcN菌液置于瓊脂板上孔中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，做3個重復(fù)，取平均值判定抑菌效果。

1.5 β-防御素-2和Toll樣受體水平的檢測

試驗分為4組，試驗組分別取1 mL EcN(EcN組)、大腸桿菌K88(大腸桿菌K88組)及EcN+大腸桿菌K88混合液(體積比1∶1，EcN+大腸桿菌K88組)置于IPEC-J2細胞已長至單層的六孔培養(yǎng)板中，另以等體積PBS作為對照組，再加入2 mL DMEM不完全細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3 h后，PBS漂洗5次，胰酶消化后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管內(nèi)，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，棄上清，再漂洗、離心棄上清，然后加入1 mL蛋白質(zhì)裂解液，離心10 min取上清，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測β-防御素-2和Toll樣受體水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)整理，采用SAS 9.1.3軟件的GLM程序進行單因素方差分析，組間顯著性分析采用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以平均值和標準誤(SEM)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EcN生長曲線

EcN生長曲線如圖1所示。接種4 h后呈快速上升趨勢，顯示其進入對數(shù)生長階段，培養(yǎng)10 h后逐漸進入穩(wěn)定期，18 h后逐漸出現(xiàn)緩慢下降趨勢，24 h后此趨勢較明顯，逐漸進入衰亡階段。

2.2 EcN體外抗逆性能

EcN耐酸試驗結(jié)果如表1所示。隨模擬胃液pH的降低，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。當pH為2.5時，EcN存活率為30.26%，較對照組減少51.58%。pH為2.0和1.5時，EcN存活率分別為17.69%、10.44%，強酸性環(huán)境抑制EcN的生長。

圖1 EcN菌株生長曲線

EcN耐膽鹽試驗結(jié)果如表2所示。對照組存活率為84.95%，隨膽鹽濃度增加，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。膽鹽濃度為0.30%時，其存活率迅速下降至27.34%。當膽鹽濃度從0.30%增加至0.90%時，存活率下降趨勢較平緩。而膽鹽濃度在0.60%和0.90%時，EcN存活率分別為21.03%、15.21%。高膽鹽環(huán)境會抑制EcN的生長。

EcN溫度耐受試驗結(jié)果如圖2所示。隨水浴溫度升高和保持時間增加，EcN存活率逐漸降低。不同溫度保持30、40、50和60 s，在80 ℃時EcN存活率分別為15.86%、11.01%、5.29%和2.20%，除50和60 s差異不顯著(P>0.05)外,其余時間點差異顯著；在70 ℃時EcN存活率分別為59.03%、49.78%、43.61%和30.40%，各時間點差異顯著(P<0.05)；在65 ℃時EcN存活率分別為80.18%、73.57%、60.79%和49.34%，各時間點差異顯著(P<0.05)，存活率高于70和80 ℃。

表1 EcN耐酸試驗結(jié)果

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2和表3同。

Values in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as Table 2 and Table 3.

表2 EcN耐膽鹽試驗結(jié)果

2.3 EcN對IPEC-J2細胞的黏附作用

以測定的EcN生長曲線作參考，選用培養(yǎng)2、8、16和26 h的EcN，分別代表其遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個生長階段，進行后續(xù)試驗。

EcN對IPEC-J2細胞的黏附作用結(jié)果如圖3和表3所示。不同生長階段的EcN對IPEC-J2細胞黏附率差異顯著(P<0.05)。以對數(shù)期EcN的黏附性能最佳，其每100個細胞黏附細菌數(shù)為3 056個，黏附率達33.96%；其次是穩(wěn)定期，每100個細胞黏附細菌數(shù)為2 043個，黏附率達22.70%；遲緩期和衰亡期的黏附性能分別居于第3和第4，每100個細胞黏附細菌數(shù)分別為1 174、661個，黏附率分別達13.04%、7.34%。

2.4 EcN對大腸桿菌K88的抑制作用

EcN對大腸桿菌K88的黏附抑制試驗結(jié)果如表4所示。EcN對大腸桿菌K88的黏附抑制率達到87.84%。抑菌試驗測得抑菌圈直徑為4.73 mm。結(jié)果表明，EcN對大腸桿菌K88具有良好的抑制效果。

同折線數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Values of the same curve with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖2 EcN溫度耐受試驗結(jié)果

Fig.2 Test results of temperature tolerance of EcN

2.5 EcN對IPEC-J2細胞 β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響

EcN對IPEC-J2細胞 β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響如圖4所示。對照組β-防御素-2水平顯著低于EcN組和EcN+大腸桿菌K88組(P<0.05)，而與大腸桿菌K88組差異不顯著(P>0.05)，對照組Toll樣受體4水平顯著低于其他3組(P<0.05)。EcN組的β-防御素-2和Toll樣受體4水平低于EcN+大腸桿菌K88組，但差異不顯著(P>0.05)。此外，大腸桿菌K88組β-防御素-2和Toll樣受體4水平略低于EcN組和EcN+大腸桿菌K88組，但差異均不顯著(P>0.05)。

A：對照 control；B：2 h；C：8 h；D：16 h；E：26 h。

表4 EcN對大腸桿菌K88的黏附抑制試驗結(jié)果

“+”代表抑菌圈直徑在0～3 mm；“++”代表抑菌圈直徑在3～6 mm。

“+” means antibacterial diameter in 0 to 3 mm; “++” means antibacterial diameter in 3 to 6 mm.

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Data columns with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

圖4 EcN對IPEC-J2細胞β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響

Fig.4 Effects of EcN on β-defensins-2 and TLR-4 levels of IPEC-J2 cells

3 討 論

3.1 EcN的體外抗逆性能

研究表明，EcN擁有6種獨特的鐵攝取系統(tǒng)能產(chǎn)生鐵螯合劑[腸菌素(enterobactin)、沙門菌螯鐵蛋白(salmochelin)、耶爾森桿菌素(yersiniabactin)、產(chǎn)氣菌素(aerobactin)、枸櫞酸鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(ferric dicitrate transport system)和楚血紅素轉(zhuǎn)運位點(the chu heme transport locus)]，攝取環(huán)境中的鐵離子(Fe3+)，用于代謝時能量的產(chǎn)生。而中性偏酸性條件更有利于EcN鐵攝取系統(tǒng)產(chǎn)生4種鐵螯合劑(enterobactin、salmochelin、aerobactin和yersiniabactin)[8]。由此推測，中性偏酸性環(huán)境更適宜EcN生存。雖然本試驗EcN存活率隨模擬胃液pH的降低而降低，但仍保持一定的存活，可見EcN對胃酸環(huán)境具有一定的耐受能力。豬胃內(nèi)pH一般在2.0～3.5，飼糧變化會使胃酸pH在1.5～5.0波動，試驗結(jié)果顯示，在pH 2.5的模擬胃液中EcN也能存活，提示其能通過胃酸環(huán)境，進入腸道發(fā)揮益生作用。EcN除需要耐受胃酸環(huán)境外，還應(yīng)耐受腸道中膽鹽形成的高滲透壓環(huán)境。豬腸道內(nèi)膽鹽含量一般在0.03%～0.50%內(nèi)波動，而本試驗顯示高膽鹽濃度(0.90%)環(huán)境下的EcN也依然能存活，可見EcN對腸道中的膽鹽環(huán)境也具有一定的耐受能力。此外，EcN在高溫環(huán)境中也能保持存活，表明其對溫度具有一定的耐受能力。關(guān)于益生菌耐酸、耐膽鹽、耐熱性能的具體機制，Hatice等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能產(chǎn)生胞外多糖，能耐受較低的pH和高膽鹽環(huán)境，Turpin等[10]從分子水平發(fā)現(xiàn)益生菌乳酸片球菌(P.acidilactici)存在多種與耐酸、耐膽鹽、耐熱相關(guān)基因，如熱休克蛋白(groEL)基因、D-丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(dltD)基因、clpL(一種ATP酶)基因和膽汁酸水解酶(bsh)基因等。因此，關(guān)于益生菌EcN耐受強酸高膽鹽高溫環(huán)境是否也存在上述相關(guān)或者其他潛在機制，還有待進一步研究。

3.2 EcN的黏附性能和抑菌性能

本試驗對比研究了4個時期的EcN對IPEC-J2細胞黏附能力的大小，其黏附效果以對數(shù)期最佳。熊濤等[11]發(fā)現(xiàn)Caco-2細胞黏附羅伊氏乳桿菌數(shù)隨菌齡增大呈先增后減的趨勢。這提示EcN能良好地黏附于IPEC-J2細胞表面可能與其生長階段存在關(guān)聯(lián)。菌毛是細菌附著于動物消化道黏膜上皮細胞表面的重要結(jié)構(gòu)，EcN自身基因組編碼的F1A、F1C和卷曲菌毛能幫助其定植于IPEC-J2細胞上，并形成生物被膜抵御致病菌入侵。若缺乏F1C菌毛和鞭毛的表達，則會降低黏附性能和削弱對沙門氏菌入侵的抑制作用[12]。也有文獻報道，EcN通過F1C菌毛調(diào)控對細胞的黏附作用以及對致病菌的抑菌作用。EcN誘導(dǎo)IPEC-J2細胞分泌β-防御素-2和促進T細胞中Toll樣受體4的表達，對抑制病原菌入侵和減輕腸道炎癥具有重要作用，同時EcN誘導(dǎo)β-防御素-2的分泌可能與鞭毛存在關(guān)聯(lián)；若EcN缺失編碼F1C菌毛和鞭毛基因，黏附率分別降低99.9%和50.0%，同時降低抑菌能力[13]。此外，EcN在IPEC-J2細胞上黏附和生長期間會形成鞭毛，其鞭毛長度和數(shù)量隨培養(yǎng)時間的增加而增加[14]。由此可見，EcN良好地黏附于細胞表面發(fā)揮益生作用，F(xiàn)1C菌毛和鞭毛起著重要的作用。本試驗關(guān)于EcN誘導(dǎo)IPEC-J2細胞對β-防御素-2和Toll樣受體4的表達以及黏附作用機理只作了初步探究，而更深層次的黏附性能和抗菌機制仍需要進一步研究。

本試驗中，用大腸桿菌K88感染預(yù)先與EcN培養(yǎng)一段時間的IPEC-J2細胞，發(fā)現(xiàn)EcN對大腸桿菌K88黏附抑制率達87.84%。Boudeau等[15]先將IPEC-J2細胞與EcN預(yù)先培養(yǎng)一段時間后再加入致病性大腸桿菌進行培養(yǎng)和直接將2種菌同時加入IPEC-J2細胞進行培養(yǎng)，對比研究EcN對致病性大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的抑制率為97.2%～99.9%，后者為78.0%～99.9%。Klete等[16]和Malchow等[17]也報道了預(yù)先將EcN與IPEC-J2細胞培養(yǎng)，能降低致病性大腸桿菌對細胞的感染機率，并影響致病菌對細胞的黏附和侵襲能力，而將EcN與沙門氏菌同時加入時，僅減少沙門氏菌入侵率為70%[18]。推測EcN對細胞的黏附作用以及其生理功能的發(fā)揮可能存在時間效應(yīng)。研究表明，增加EcN與細胞的預(yù)先培養(yǎng)時間有利于抑制病原菌的入侵，同時提高EcN的劑量，抑制效果更好[12]。EcN預(yù)先培養(yǎng)和較高劑量使用也有利于提高腸道黏蛋白mRNA的表達水平[19]。綜上研究，EcN制劑在生產(chǎn)實踐中盡早并高劑量使用，可能會更好的發(fā)揮益生作用。

本試驗只對EcN相關(guān)機理只作了初步的探索，關(guān)于EcN黏附機理和對致病菌黏附抑制作用以及抗逆性能的研究，還需要從分子水平進行更深入的探索。

4 結(jié) 論

① EcN對豬腸上皮細胞黏附效果以對數(shù)期最佳，并對致病菌大腸桿菌K88存在較強的抑制作用。

② EcN面對高酸、高膽鹽環(huán)境也呈現(xiàn)一定的抗逆性能，有利于其在胃腸道內(nèi)發(fā)揮生理作用。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail： tangzhiru2326@sina.com

(責任編輯 王智航)

ProbioticsEscherichiacoliNissle 1917: Stress Resistance, Swine Intestinal Epithelial Cell Adhesion Rate and Antimicrobial Effects

LI Jinlong DENG Huan LIU Jinyan MAO Junxia WANG Yao TANG Zhiru*

(KeyLaboratoryforBio-FeedandAnimalNutrition,CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

This experiment was conducted to investigate stress resistance, swine intestinal epithelial cell adhesion rate and antimicrobial effects of probioticsEscherichiacoliNissle 1917 (EcN). The growth curve, acid, bile salt and heat tolerance were analyzed usinginvitromethods; IPEC-J2 cells of swine intestinal epithelial cells were selected as theinvitrocell model to investigate the effects of EcN on adhesion rate and inhibition rate of adhesion to an pathogenic bacteriumEscherichiacoliK88; meanwhile, the effects of EcN on levels of β-defensin-2 and toll-like receptor 4 of IPEC-J2 cells were identified by Western blot. The results showed as follows: 1) EcN could survive in strong acid, high concentration of bile salt and high temperature. 2) EcN in logarithmic phase had the highest intestinal epithelial cell adhesion effect and its adhesion rate was 33.96%, which was significantly higher than that in retardation phase, stationary phase and decline phase (P<0.05). 3) EcN had good inhibitory effect on pathogenic bacteriumEscherichiacoliK88 and its inhibition rate of adhesion was 87.84%. 4) EcN could up-regulate the levels of β-defensins-2 and toll-ike receptor 4. In conclusion, the probiotics EcN presents stress resistance, has great swine intestinal epithelial cells adhesion capacity, and prevents attack from pathogenic bacteriaEscherichiacoliK88.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1241-1247]

EscherichiacoliNissle 1917; swine intestinal epithelial cell; IPEC-J2 cell; adhesion property; stress resistance; heat tolerance; antimicrobial effects

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.020

2016-10-09

重慶市自然科學(xué)基金(cstc2016jcyjA1414)；西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(XDJK2015D005)；國家973重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2013CB127303)；國家948項目(2015Z74)

李金龍(1992—)，男，重慶人，碩士研究生，從事分子營養(yǎng)學(xué)與生物飼料資源開發(fā)利用研究。E-mail: 812453072@qq.com

*通信作者:唐志如，副研究員，E-mail： tangzhiru2326@sina.com

S816.7

A

1006-267X(2017)04-1241-07