陳言言 劉伯帥 陳躍鵬 朱曉艷 袁德地 齊勝利 王成章 史瑩華

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州450002)

苜蓿皂苷對膽固醇逆向轉運基因三磷酸腺苷結合盒轉運體A1、清道夫受體BⅠ mRNA表達的影響

陳言言 劉伯帥 陳躍鵬 朱曉艷 袁德地 齊勝利 王成章 史瑩華*

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州450002)

本試驗以大鼠肝臟和肝臟細胞(BRL細胞)及小鼠巨噬細胞(ANA-1細胞)為研究對象，從動物和細胞水平上研究苜蓿皂苷對膽固醇逆向轉運基因三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)、清道夫受體BⅠ(SR-BⅠ)mRNA表達的影響。取雄性健康SD大鼠32只，隨機分成4組，分別為正常對照組、苜蓿皂苷組、高脂模型組和高脂苜蓿皂苷組，每組8只。正常對照組和苜蓿皂苷組飼喂基礎飼糧，其余2組均飼喂高脂飼糧，飼喂4周后，苜蓿皂苷組和高脂皂苷組從第5周開始每天灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷，灌胃4周。采用胎牛血清作用于BRL細胞48 h，構建脂變模型，將BRL細胞分為正常對照組(正常細胞)、苜蓿皂苷組(正常細胞)、脂變模型組(脂變細胞)和脂變皂苷組(脂變細胞)，苜蓿皂苷組、脂變皂苷組培養(yǎng)液中添加苜蓿皂苷(終濃度300 μg/mL)，培養(yǎng)24 h。采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于ANA-1細胞48 h，構建荷脂模型，將ANA-1細胞分為正常對照組(正常細胞)、苜蓿皂苷組(正常細胞)、荷脂模型組(荷脂細胞)和荷脂皂苷組(荷脂細胞)，苜蓿皂苷組、荷脂皂苷組培養(yǎng)液中添加苜蓿皂苷(終濃度300 μg/mL)，培養(yǎng)24 h。采用熒光定量PCR法測定大鼠肝臟、BRL細胞和ANA-1細胞中ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量。結果表明：1)苜蓿皂苷顯著提高了正常大鼠肝臟ABCA1和SR-BⅠ mRNA表達量(P<0.05)，顯著提高了高脂大鼠肝臟ABCA1 mRNA的表達量(P<0.05)，對高脂大鼠肝臟SR-BⅠ mRNA表達量影響不顯著(P>0.05)；2)苜蓿皂苷顯著提高了正常BRL細胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達量(P<0.05)，而對脂變BRL細胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA表達量影響不大(P>0.05)；3)苜蓿皂苷顯著降低正常ANA-1細胞ABCA1 mRNA表達量(P<0.05)。由此可見，苜蓿皂苷可通過上調大鼠肝臟和正常肝臟細胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達促進膽固醇的逆向轉運，增強肝臟膽固醇排泄，從而發(fā)揮其對高脂血癥的預防和治療作用。

苜蓿皂苷；BRL細胞；ANA-1細胞；大鼠；膽固醇逆向轉運；mRNA表達量

隨著社會現(xiàn)代化的發(fā)展，人們的生活質量得到不斷的提高，但是也帶來了不利的影響。血脂異常，尤其是血液中膽固醇含量的升高是導致動脈粥樣硬化和冠狀動脈心臟疾病發(fā)生的主要因素。在正常情況下，大部分膽固醇是細胞膜的結構成分，其余是通過血流運至肝臟、腎上腺、卵巢、睪丸、皮膚等組織和器官，之后被合成為膽汁酸、激素和維生素D。膽固醇和其他脂質以及各種載脂蛋白共同組成數(shù)種脂蛋白[1]。人類80%膽固醇在肝外組織合成，極少一部分來源于血漿中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。為防止肝外組織膽固醇的積聚，肝外組織合成的膽固醇由高密度脂蛋白(HDL)攜帶經(jīng)血流轉運至肝臟，合成膽汁酸[2]。在膽固醇從肝外組織向肝臟轉運的過程中，HDL具有重要的作用。大規(guī)模臨床試驗證實，HDL含量與心血管疾病呈負相關。而HDL的代謝是相當復雜的，它涉及許多代謝通路，HDL作為膽固醇受體不斷地移走細胞膜上的膽固醇，導致細胞內多余膽固醇的外流，這一過程是由識別載脂蛋白A1(apoA-1)和清道夫受體BⅠ(SR-BⅠ)介導的。最近，路倩等[3]報道了非受體介導的方式，即通過三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)清除外周組織膽固醇的方式。ABCA1屬于三磷酸腺苷結合盒轉運體(ABC)基因家族一員，ABCA1編碼的蛋白參與生物膜間物質的轉運，ABCA1編碼的蛋白質稱作膽固醇外流調節(jié)蛋白(CERP)，參與膽固醇外流，促使膽固醇轉移到apoA-1和HDL。

目前，在植物中發(fā)現(xiàn)具有降低膽固醇作用的主要活性成分有皂苷類、酮類、萜類等。其中皂苷具有多種生物學功能，是植物中降低機體膽固醇含量的重要有效成分。因此，苜蓿皂苷成為植物提取物中降血脂藥物研究和開發(fā)的一個重點。

苜蓿皂苷是從苜蓿中提取的具有獨特生物學活性的物質，是由糖中羥基或非糖類化合物的羥基以縮醛鏈脫水縮合而成的環(huán)狀縮醛鏈物，其結構為五環(huán)三萜烯類化合物[4]。早在20世紀50年代，國外就開始研究苜蓿皂苷，主要在提取、分離、結構鑒定方面做了大量的工作，有關這方面的研究報道很多。近年來，我國學者對苜蓿皂苷的研究也取得一定的成績。王先科等[5]研究了苜蓿皂苷通過促進肝臟膽固醇7-羥化酶(CYP7A1)和低密度脂蛋白受體(LDL-R)的表達，增強肝臟膽固醇的排泄，發(fā)揮其對高脂血癥的預防和治療作用。Liang等[6]以大鼠肝臟細胞(BRL細胞)為對象，研究苜蓿皂苷對膽固醇代謝相關基因表達的影響，從而探究苜蓿皂苷在細胞水平上對膽固醇代謝的調節(jié)作用。本試驗通過苜蓿皂苷在大鼠肝臟和BRL細胞及小鼠巨噬細胞(ANA-1細胞)中對膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport,RCT)相關基因ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達，初步探討苜蓿皂苷對RCT的影響及其機制，為其在動物生產(chǎn)中的應用提供可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苜蓿皂苷(河北寶恩公司，由苜蓿草粉經(jīng)醇提法與大孔樹脂柱分離純化得到，經(jīng)薄層層析法檢測其主要成分為苜蓿皂苷，經(jīng)紫外分光光度法檢測其中總皂苷含量為51%)、32只雄性健康SD無特定病原體(SPF)級大鼠(河南省實驗動物中心)、全自動生化分析儀(HITACHI7170A，HITACHI公司)、臺式高速冷凍離心機(Eppendorf公司)、總膽固醇(TC)測定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司)、總膽汁酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、酶標儀(Multiskan GO 1.00.40，Thermo公司)、HDL和低密度脂蛋白(LDL)測定試劑盒(廣州達爾斯科生物科技有限公司)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司)、大鼠BRL細胞和ANA-1細胞(中國科學院上海生科院細胞資源中心)、噻唑藍(MTT)(Solarbio公司)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京協(xié)生生物科技有限責任公司)、高糖DMEM培養(yǎng)液(Solarbio公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、RPMI-1640培養(yǎng)液(Solarbio公司)、胰酶(Solarbio公司)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)、25 cm2培養(yǎng)瓶(Coming公司)、6孔板和96孔板(Coming公司)、血細胞計數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)、總RNA提取試劑(Invitrogen公司)、熒光定量PCR試劑盒[東洋紡(上海)生物科技有限公司]、反轉錄試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]、2×Taq PCR Master Mix(北京康為世紀生物科技有限公司)、瓊脂糖(Invitrogen公司)。

1.2 動物試驗

預試期(1周)結束后，將32只雄性健康SD大鼠[體重(191.41±16.01) g]隨機分為2組，分別為正常組、高脂組，各組之間血清TC含量和體重無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。采用飼喂高脂飼糧的方法建立大鼠高脂模型。正常組飼喂基礎飼糧(表1)，高脂組飼喂高脂飼糧。高脂飼糧組成：1.0%膽固醇、0.1%豬膽鹽、10.0%豬油、5.0%蛋黃粉、5.0%全脂奶粉、78.9%基礎飼糧。建模時間為4周。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

建模結束后，根據(jù)血清TC含量和體重分別將正常組和高脂組各隨機分為2組，分組情況及具體試驗設計如下。正常對照組：飼喂基礎飼糧，每天09:00灌胃2 mL蒸餾水；苜蓿皂苷組：飼喂基礎飼糧，每天09:00灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷2 mL；高脂模型組：飼喂高脂飼糧，每天09:00灌胃2 mL蒸餾水；高脂皂苷組：飼喂高脂飼糧，1～4周每天09：00灌胃2 mL蒸餾水，從第5周開始，每天09：00灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷，連續(xù)灌胃4周。各組大鼠均自由飲水、采食。

樣本的采集與制備：試驗結束后，所有大鼠禁食過夜，麻醉后沿大鼠腹部中部剖開，取肝臟相同部位，吸干血跡用錫箔紙包裝好后，迅速置于液氮中冷凍，并保存于-80 ℃冰箱待測。

1.3 BRL細胞試驗

1.3.1 脂變BRL細胞模型的建立[7]

BRL細胞接種于50 mL的細胞培養(yǎng)瓶中，用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁長滿瓶底，胰酶消化，計數(shù)后接種于6孔板中，每孔接種約1.5×105個細胞，待細胞長滿80%后，更換新鮮培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入50%胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h至出現(xiàn)細胞內脂滴或泡沫樣物沉積，即制成脂變細胞模型。將所得細胞改置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，使其靜止24 h，再做相應的處理。

1.3.2 試驗分組

細胞用六孔板培養(yǎng)，試驗分為4個組，每組6個重復，具體分組情況如下。

正常對照組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

苜蓿皂苷組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液，培養(yǎng)24 h。

脂變模型組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換成含50%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

脂變皂苷組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換成含50%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液，培養(yǎng)24 h。

1.4 ANA-1細胞試驗

將ANA-1細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，鋪滿瓶底即可，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。注意更換新鮮培養(yǎng)液。細胞密度達到2×106個/mL更換培養(yǎng)液，定期將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，觀察細胞形態(tài)。

1.4.1 荷脂ANA-1細胞模型的建立

試驗前以無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞12 h，使細胞處于靜止狀態(tài)。用50 mg/L的ox-LDL作用于細胞48 h，制成荷脂ANA-1細胞模型。

1.4.2 試驗分組

細胞用六孔板培養(yǎng)，試驗分為為4個組，每組6個重復，具體分組情況如下。

正常對照組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

苜蓿皂苷組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL 300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液培養(yǎng)24 h。

荷脂模型組：六孔板每孔添加2.8 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，100 μL 1.45 μg/μL的ox-LDL(終濃度50 mg/L)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

荷脂皂苷組：六孔板每孔添加2.8 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，100 μL 1.45 μg/μL的ox-LDL(終濃度50 mg/L)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中靜止24 h，再加入100 μL 300 μg/mL(終濃度為100 μg/mL)苜蓿皂苷溶解液的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.5 指標測定與方法

1.5.1 MTT法測定苜蓿皂苷對BRL和ANA-1細胞活性的影響

用濃度為2×104個/mL的細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后加入不同劑量的苜蓿皂苷，終濃度分別為0(對照)、50、100、200、250 μg/mL。每組6個重復孔，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h，顯微鏡觀察其效果，去上清液，加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT孵育，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL振蕩10 min，以無細胞空白孔為零點，用酶標儀在波長490 nm處檢測各孔吸光度值(OD)。

1.5.2 大鼠肝臟、BRL細胞和ANA-1細胞基因mRNA相對表達量測定

1.5.2.1 肝臟和細胞總RNA提取

Trizol法提取總RNA，保存于-80 ℃，以備后續(xù)試驗使用。

1.5.2.2 總RNA濃度的測定

采用Thermo微量紫外分光光度計260 nm處測定總RNA濃度，并記錄OD260 nm/OD280 nm，結果在1.8～2.0的樣本滿足要求。

1.5.2.3 總RNA的質量檢測

用1%瓊脂糖凝膠膠電泳鑒定總RNA的完整性。

1.5.2.4 總RNA反轉錄

采用大連寶生物工程公司提供的Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H-)試劑盒，按照說明書進行操作，得到cDNA產(chǎn)物。

1.5.2.5 引物設計與合成

根據(jù)GenBank大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、ABCA1、SR-BⅠ DNA序列，小鼠β肌動蛋白(β-actin)、ABCA1、SR-BⅠ DNA序列運用Primer 5.0設計引物，引物序列及參數(shù)見表2。

1.5.2.6 熒光定量PCR

本試驗采用SYBR qPCR Mix為熒光染料，經(jīng)過摸索確定最佳反應體系如下：SYBR-qPCR Mix 5 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水3.8 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物各0.1 μL，總體系為10 μL。按照以下條件進行熒光定量PCR：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，此步驟40個循環(huán)；溶解曲線，產(chǎn)物20 ℃保存10 min。根據(jù)本試驗條件，采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行分析處理。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進行組間多重比較，以P<0.05表示差異顯著，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 苜蓿皂苷對BRL細胞、ANA-1細胞活性的影響

由表3可知，苜蓿皂苷添加終濃度為50、100 μg/mL時，BRL細胞活性與對照組相比差異不大，而200、250 μg/mL時BRL細胞活性升高，且與對照組相比差異顯著(P<0.05)。苜蓿皂苷添加終濃度為50、100、200、250 μg/mL時ANA-1細胞活性與對照組差異不顯著(P>0.05)。苜蓿皂苷濃度在100 μg/mL以下時對BRL細胞和ANA-1細胞都未見毒性。

表2 引物序列及參數(shù)

表3 苜蓿皂苷對BRL細胞、ANA-1細胞活性的影響

同列數(shù)據(jù)肩標相同或無小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 苜蓿皂苷對大鼠肝臟ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量的影響

由表4可知，與正常對照組相比，苜蓿皂苷組、高脂模型組、高脂皂苷組ABCA1 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，分別是正常對照組的8.34、3.86、9.57倍；與正常對照組相比，苜蓿皂苷組SR-BⅠ mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，分別是正常對照組的12.07、2.77、2.94倍;與高脂模型組相比較，高脂皂苷組ABCA1 mRNA表達量顯著上升(P<0.05)，SR-BⅠ mRNA表達量則變化不大，差異不顯著(P>0.05)。

2.3 苜蓿皂苷對BRL細胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量的影響

由表5可知，與正常對照組相比，苜蓿皂苷組、脂變模型組、脂變皂苷組ABCA1 mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，分別是正常對照組的5.97、1.46、1.47倍；與脂變模型組相比，脂變皂苷組ABCA1 mRNA表達量沒有顯著變化(P>0.05)。與正常對照組相比，苜蓿皂苷組SR-BⅠ mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，是正常對照組的1.69倍，脂變模型組和脂變皂苷組顯著降低(P<0.05)，分別是正常對照組的0.17、0.35倍；與脂變模型組相比較，脂變皂苷組SR-BⅠ mRNA的表達量略有升高，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 苜蓿皂苷對大鼠肝臟ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量的影響

表5 苜蓿皂苷對BRL細胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量的影響

2.4 苜蓿皂苷對ANA-1細胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量的影響

由表6可知，與正常對照組相比較，苜蓿皂苷組、荷脂模型組、荷脂皂苷組ABCA1 mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，是正常對照組的0.59、0.24、0.26倍。與正常對照組相比，苜蓿皂苷組SR-BⅠ mRNA表達量略有下降(P>0.05)，是正常對照組的0.60倍，荷脂模型組和荷脂皂苷組則顯著提高(P<0.05)，分別是正常對照組的4.56、4.07倍；與荷脂模型組相比較，荷脂皂苷組ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量均沒有顯著變化(P>0.05)。

表6 苜蓿皂苷對ANA-1細胞ABCA1、SR-BⅠ mRNA表達量的影響

3 討 論

血脂是血液中所含各類脂質的總稱，包括膽固醇、TG、磷脂(PL)和游離脂肪酸(FFA)等。本課題組前期研究表明，苜蓿皂苷可以能降低高脂血癥大鼠血清中TC、TG和LDL-C含量，表明苜蓿皂苷具有良好的降血脂效應[8]。

HDL的抗動脈粥硬化性疾病作用主要基于HDL參與的RCT過程。而苜蓿皂苷具有溶血作用，將其水溶液注射入血液，低濃度時即可使紅細胞破裂。一般認為溶血作用與皂苷和紅細胞膜中膽固醇的相互作用有關。本試驗用MTT法檢測苜蓿皂苷對BRL細胞、ANA-1細胞生長的影響，以確定苜蓿皂苷對這2種細胞是否具有毒性，并確定細胞培養(yǎng)過程中苜蓿皂苷的添加量，為后續(xù)試驗打下基礎。本試驗結果表明，苜蓿皂苷濃度小于100 μg/mL時對BRL細胞的活性并無影響，苜蓿皂苷各個劑量對ANA-1細胞的影響差異均不顯著，但濃度高于100 μg/mL時，ANA-1細胞活性有下降趨勢，故選取100 μg/mL作為細胞培養(yǎng)過程中苜蓿皂苷的添加量。

組成生物膜系統(tǒng)的重要成分——膽固醇的攝取、合成以及排出之間存在著動態(tài)平衡，這個平衡是維持細胞膜系統(tǒng)與細胞基本生命活動的關鍵。RCT是指新生的圓盤狀HDL從外周細胞(包括動脈壁細胞)中攝取過剩的膽固醇，在血漿中經(jīng)卵磷脂膽固醇?；D移酶(lecithin cholesterolacyl transferase,LCAT)酯化后，游離膽固醇轉變?yōu)槟懝檀贾⑾騂DL的內核轉移，最終形成球狀的成熟HDL，將膽固醇轉運至肝臟，主要通過生成膽汁酸的形式排出體外的過程[9-10]。機體通過這一過程阻斷泡沫細胞的形成，是HDL抗動脈粥樣硬化的最主要機制之一。目前已知有3條膽固醇流出通路，分別為apoA-1/ABCA1通路、SR-BⅠ途徑和液相擴散途徑。本試驗選取了RCT過程中的2種關鍵基因ABCA1、SR-BⅠ，從個體和細胞水平研究苜蓿皂苷對其mRNA表達的影響，初步探討苜蓿皂苷對RCT的調控機制。

ABCA1是ABC超家族的成員之一，能促進細胞內膽固醇流出而參與RCT過程,從而清除組織過量的膽固醇[11]。它是近年來新發(fā)現(xiàn)的啟動細胞內膽固醇外流、形成HDL、增加RCT的關鍵因子，ABCA1介導RCT的第1步，也是限速步驟，對脂質代謝和動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展具有重要影響。大量研究表明，高表達ABCA1的轉基因小鼠可以通過升高血清中HDL含量，降低LDL含量，加速體內膽固醇的流出[12-14]；同時，ABCA1在巨噬細胞清除過多的膽固醇，阻止動脈粥樣硬化進展方面發(fā)揮重要作用[15]。本試驗結果表明，添加苜蓿皂苷后正常和高脂大鼠肝臟中ABCA1 mRNA表達量均顯著升高，正常BRL細胞中ABCA1 mRNA表達量也顯著升高，說明苜蓿皂苷可通過上調ABCA1 mRNA的表達來增加RCT。而添加苜蓿皂苷后脂變BRL細胞中ABCA1 mRNA的表達量變化不大，推測苜蓿皂苷對大鼠肝臟ABCA1的影響是代償性的而非直接作用，具體機制有待進一步研究。添加苜蓿皂苷后正常ANA-1細胞中ABCA1 mRNA表達量下降，荷脂ANA-1細胞中ABCA1 mRNA的表達量變化并不大。這說明苜蓿皂苷并不能促進巨噬細胞中RCT。對比大鼠肝臟、BRL細胞和ANA-1細胞的試驗結果可發(fā)現(xiàn)，苜蓿皂苷主要是促進肝臟細胞中RCT，而對巨噬細胞中RCT影響不大。

SR-BⅠ屬于CD36超家族成員，主要分布及發(fā)揮重要作用的組織器官是肝臟，還有如腎上腺、卵巢、睪丸等產(chǎn)生甾體類激素的組織中，而且在選擇性攝取HDL-C的組織中SR-BⅠ含量較多，此外在一些組織細胞中有低水平表達。SR-BⅠ是HDL受體，而且同時具有多個配體的結合位點。SR-BⅠ與HDL結合后，介導膽固醇脂選擇性攝取，在該過程中SR-BⅠ作為HDL受體，可直接將HDL-C選擇性攝取。HDL流出速率與細胞SR-BⅠ mRNA表達呈正相關。研究發(fā)現(xiàn)，SR-BⅠ在肝臟中過表達同時伴隨著血漿中HDL-C含量的降低和膽汁中膽固醇含量的升高；相反，對SR-BⅠ基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，血液循環(huán)中TC含量增加，尤其HDL-C含量。故而認為，SR-BⅠ基因可參與RCT途徑，將血液及組織細胞中過多的膽固醇轉運至肝及其他可利用的器官形成膽汁酸和類固醇類激素從而達到清除過多血脂，防止動脈粥樣硬化發(fā)生的作用[16]。本試驗結果表明，苜蓿皂苷主要影響正常大鼠肝臟和正常BRL細胞中SR-BⅠ mRNA表達，而對高脂大鼠和脂變BRL細胞中SR-BⅠ mRNA表達影響不大，推測苜蓿皂苷參與調節(jié)正常肝臟細胞SR-BⅠ mRNA表達，對脂變肝臟細胞中SR-BⅠ mRNA表達調節(jié)較少。這說明血脂水平的高低影響體內膽固醇的代謝，因此研究苜蓿皂苷對膽固醇代謝的影響時應考慮血脂水平的差異。苜蓿皂苷對正常和荷脂ANA-1細胞中SR-BⅠ mRNA表達量的影響均不大，推測苜蓿皂苷對巨噬細胞中SR-BⅠ參與調節(jié)RCT無影響，具體的作用機制還需進一步研究[17]。

4 結 論

苜蓿皂苷可通過上調大鼠肝臟和正常肝臟細胞ABCA1和SR-BⅠ mRNA的表達促進膽固醇的逆向轉運，增強肝臟膽固醇排泄，從而發(fā)揮其對高脂血癥的預防和治療作用。

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*Corresponding author, professor, E-mail: annysyh@126.com

(責任編輯 王智航)

Effects of Alfalfa Saponins mRNA Expressions of Reverse Cholesterol Transport Genes: ATP-Binding Cassette Transporter A1 and Scavenger Receptor Class B Type Ⅰ

CHEN Yanyan LIU Boshuai CHEN Yuepeng ZHU Xiaoyan YUAN Dedi QI Shengli WANG Chengzhang SHI Yinghua*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002，China)

Rat liver, rat liver cells (BRL cells) and mouse macrophages (ANA-1 cells) were used to investigate the effects of alfalfa saponins (AS) on mRNA expressions of reverse cholesterol transport genes, which were ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) and scavenger receptor class B type Ⅰ(SR-BⅠ), and discuss the effects of AS from animal and cellular levels. Thirty two healthy male SD rats were randomly divided into four groups: normal control group, AS group, hyperlipidemic model group and hyperlipidemic saponins group, and each group had 8 rats. Rats in normal control group and AS group were fed a basal diet, and those in the other two groups were fed a high-fat diet. After 4 weeks feeding, AS [240 mg/(kg·d)] was intragastric administered to rats in AS group and hyperlipidemic saponins group from weeks 5 to 8. BRL cells were incubated with fetal bovine serum for 48 h to constitute hyperlipidemic model. BRL cells were divided into four groups, which were normal control group (normal cells), AS group (normal cells), hyperlipidemic model group (hyperlipidemic cells) and hyperlipidemic saponins group (hyperlipidemic cells), and AS (final concentration 300 μg/mL) was added to culture medium in AS group and hyperlipidemic saponins group to culture for 24 h. ANA-1 cells were incubated with oxidized low density lipoprotein for 48 h to constitute lipid-loaded model. ANA-1 cells were divided into four groups, which were normal control group (normal cells), AS group (normal cells), lipid-loaded model group (lipid-loaded cells) and lipid-loaded saponins group (lipid-loaded cells), and AS (final concentration 300 μg/mL) was added to culture medium in AS group and lipid-loaded saponins group to culture for 24 h. The mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠ in rat liver, BRL cells and ANA-1 cells were determined by fluorescent quantitative PCR. The results showed as follows: 1) AS significantly increased the mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠ in liver of normal rats and ofABCA1 in liver of hyperlipidemic rats (P<0.05)， but had no significant effects on that ofSR-BⅠ in liver of hyperlipidemic rats (P>0.05); 2)AS significantly increased the mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠ in normal BRL cells(P<0.05), but had no significant effects on those in hyperlipidemic BRL cells (P>0.05); 3) AS significantly reduced the mRNA expression ofABCA1 in normal ANA-1 cells (P<0.05). In conclusion, AS might promote reverse cholesterol transport by up-regulating the mRNA expressions ofABCA1 andSR-BⅠin rat liver and normal BRL cells, promote the excretion of liver cholesterol, and play prevention and curing effects on hyperlipidemia.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1446-1454]

alfalfa saponins; BRL cells; ANA-1 cells; rat; cholesterol reverse transport; mRNA expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.044

2016-10-14

國家自然科學基金(31301983)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-35)；河南農(nóng)業(yè)大學科技創(chuàng)新基金(30600968)

陳言言(1989—),女，河南商丘人，碩士研究生，從事牧草營養(yǎng)與利用研究。E-mail: 1220675190@qq.com

*通信作者：史瑩華，教授，碩士生導師，E-mail: annysyh@126.com

S816.7

A

1006-267X(2017)04-1446-09