楊 霞 趙 峰* 李 珂 黨方昆 張 虎 尹麗婷 張宏福

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.新希望六和股份有限公司，北京100102)

玉米干酒糟及其可溶物有效能值估測模型中定標樣品選擇方法的研究

楊 霞1趙 峰1*李 珂2黨方昆1張 虎1尹麗婷2張宏福1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.新希望六和股份有限公司，北京100102)

本試驗旨在探討玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)有效能值估測模型中定標樣品的選擇原則。從23個玉米DDGS樣品(定義為全樣品庫)中按酶水解物能值(EHGE)相差0.21 MJ/kg左右的梯度選擇9個定標玉米DDGS樣品，定義為選擇性樣品庫；將剩余的14個玉米DDGS樣品定義為非選擇性樣品庫。然后，比較選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫化學成分含量及變異的差異，以及通過全樣品庫和選擇性樣品庫分別建立其化學成分對EHGE之間的回歸模型，比較根據(jù)回歸模型計算得到的非選擇性樣品庫EHGE的差異。結(jié)果表明，選擇性樣品庫和非選擇性樣品庫的玉米DDGS在粗蛋白質(zhì)(CP)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量及EHGE平均值上均無顯著性差異(P>0.05)，CP、Ash、EE、CF、ADF、NDF含量及EHGE變異的方差上均無顯著性差異(P>0.05)。選擇性樣品庫和非選擇性樣品庫化學成分含量在第一、二主成分得分載荷分布上，選擇性樣品庫中僅1個玉米DDGS樣品未與非選擇性樣品庫的分布范圍重疊。以選擇性樣品庫樣品建立的EHGE預測模型為EHGE=(3 566+53.94×EE-32.68×NDF)×4.184/1 000 (R2=0.798 1，RSD=0.43 MJ/kg)；以全樣品庫樣品建立的預測模型為EHGE=(3 742+29.67×EE-29.71×NDF)×4.184/1 000 (R2=0.535 0，RSD=0.44 MJ/kg)。由2個模型獲得的非選擇性樣品庫(n=14)玉米DDGS的EHGE計算值與其實測值的絕對殘差平均值分別為0.47和0.33 MJ/kg，差異不顯著(P>0.05)。綜上所述，在玉米DDGS有效能值的估測建模中，以EHGE作為定標樣品的選擇依據(jù)是可行的。

玉米DDGS；酶水解物能值；定標樣品

在飼料可消化養(yǎng)分含量的估測模型中，定標樣品的選擇直接影響估測模型的準確性與估測精度[1]。因此，建立定標樣品的選擇依據(jù)非常重要。目前，在飼料有效能值估測方程的建模中，人們通常隨機采集一定數(shù)量的樣品，在獲得了飼料原料的化學成分數(shù)據(jù)集與有效能的實測數(shù)據(jù)后，通過逐步回歸建立有效能值的估測模型[2-3]。這種建模方法可能會出現(xiàn)因定標樣品庫自變量或因變量的變異幅度小而影響模型的估測精度及穩(wěn)定性[4-5]。同時，也可能出現(xiàn)因定標樣品的變異程度不一致，而使不同學者針對同種飼料原料有效能值的估測模型在估測因子及權重上差異較大[6]。根據(jù)回歸分析的基本原則，自變量或因變量的水平變異應呈等差距設置[7]，考慮到生物學法能檢測到飼糧處理間雞代謝能值的差異一般為0.21～0.42 MJ/kg的經(jīng)驗[8]，本研究假設從23個玉米干酒糟及其可溶物(dried distiller’s grains with solubles,DDGS)(定義為全樣品庫)中以酶水解物能值(enzymatic hydrolyzate gross energy，EHGE)相差0.21 MJ/kg左右的尺度選擇的9個定標玉米DDGS(定義為選擇性樣品庫，剩余的14個玉米DDGS樣品定義為非選擇性樣品庫)在化學成分的變異、化學成分對EHGE的回歸關系上可以代表23個玉米DDGS的特性。為此，本研究通過比較選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫在化學成分上的顯著性差異與變異程度，以全樣品庫的主成分分析比較選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫在第一、二主成分上的分布差異，以及比較以化學成分對EHGE的估測關系在選擇性樣品庫與全樣品庫的一致性，探討以飼料EHGE作為有效能值估測模型中定標樣品的選擇依據(jù)是否可行。

1 材料與方法

1.1 飼料原料

采集來源于美國以及我國山東、河南、安徽、吉林、黑龍江等地的玉米DDGS樣品23個。采用四分法取樣后分為2份，一份用萬能粉碎機粉碎并過40目篩，用于化學成分檢測；另一份粉碎后過60目篩，用于EHGE的測定。所有樣品采用抽真空-充氮氣密封，-20 ℃保存?zhèn)溆?。玉米DDGS的來源及其化學成分見表1。

表1 玉米DDGS的來源及其化學成分含量(干物質(zhì)基礎)

1.2 試驗設計

將23個玉米DDGS樣品(全樣品庫)的EHGE(EHGE極差為2.39 MJ/kg)從低到高排列，按梯度相差0.21 MJ/kg左右的尺度選擇9個定標玉米DDGS樣品，定義為選擇性樣品庫；將剩余14個玉米DDGS樣品定義為非選擇性樣品庫。首先統(tǒng)計全樣品庫、選擇性樣品庫、非選擇性樣品庫的化學成分含量及變異系數(shù)，并比較選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫化學成分的差異顯著性。然后對23個玉米DDGS樣品的化學成分及EHGE進行主成分分析，檢驗選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫的第一、二主成分得分是否重疊。最后，分別建立全樣品庫(23個玉米DDGS樣品)和選擇性樣品庫(9個定標玉米DDGS樣品)的化學成分與EHGE之間的回歸模型，以此2個模型計算非選擇性樣品庫的EHGE，比較兩者之間的差異顯著性。綜合上述統(tǒng)計分析檢驗基于EHGE選擇的9個定標玉米DDGS樣品是否可以代表23個玉米DDGS樣品的變異情況。

1.3 測定指標及方法

按GB/T 6435—2014[9]測定樣品的水分并計算其干物質(zhì)含量，并根據(jù)ISO 9831:1998的規(guī)定測定飼料樣品及經(jīng)仿生消化系統(tǒng)消化后未水解殘渣的總能(GE)。飼料樣品的粗蛋白質(zhì)(CP)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸洗滌纖維(ADF)含量分別按照GB/T 6432—1994[10]、GB/T 6438—2007[11]、GB/T 6433—2006[12]、GB/T 6434—2006[13]、GB/T 20806—2006[14]、NY/T 1459—2007[15]進行測定。EHGE的測定參照趙峰等[16]關于單胃動物仿生消化系統(tǒng)(SDS-2)測定雞飼料EHGE的操作過程進行。透析袋的型號與前處理、胃緩沖液、小腸前段緩沖液、小腸后段緩沖液及模擬消化液的制備按照《雞飼料酶水解物能值測定技術規(guī)程》進行制備。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

以SAS 9.3的MEANS模塊對全樣品庫、選擇性樣品庫、非選擇性樣品庫中玉米DDGS化學成分的基本統(tǒng)計量進行計算。根據(jù)2樣本均值差異顯著性的統(tǒng)計原理，以TTEST模塊對選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫的各化學成分含量差異顯著性進行檢驗。以PRINCOMP模塊對全樣品庫的化學成分進行主成分分析，得出第一、二主成分組成的特征向量及選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫樣品主成分得分，并通過Simca-P 11.5作特征向量與主成分得分載荷圖。以REG模塊的Stepwise選項對選擇性樣品庫與全樣品庫樣品的化學成分對EHGE進行逐步回歸，分別建立以化學成分估測EHGE的模型，命名為模型1、模型2。根據(jù)上述模型計算非選擇性樣品庫玉米DDGS的EHGE，以MEANS模塊比較2個模型EHGE計算值的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫玉米DDGS化學成分含量的差異與變異

由表2可見，在由23個玉米DDGS樣品組成的全樣品庫中，根據(jù)EHGE分成的選擇性樣品庫和非選擇性樣品庫的玉米DDGS在CP、Ash、EE、CF、NDF、ADF含量及EHGE平均值上均無顯著性差異(P>0.05)。在各化學成分含量的變異上，選擇性樣品庫和非選擇性樣品庫的玉米DDGS在CP、Ash、EE、CF、ADF、NDF、GE、EHGE的方差上無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫玉米DDGS化學成分含量的主成分分析及得分分布

由圖1、圖2可見，由23個玉米DDGS樣品的CP、Ash、EE、CF、NDF、ADF、GE及EHGE獲得的第一、二主成分對總變異的貢獻分別為51.97%和19.89%，兩者累計占總變異的71.86%。第一主成分中，EE、EHGE、CF、GE為主要權重因子。第二主成分中，Ash、ADF、NDF為主要權重因子。選擇性樣品庫(n=9)和非選擇性樣品庫(n=14)在第一、二主成分得分載荷上，選擇性樣品庫中僅1個樣品(B23)在95%的置信區(qū)間外，得分散點圖顯示選擇性樣品庫和非選擇性樣品庫未出現(xiàn)明顯的分組，因此，2組樣品在化學成分的總體變異上是類似的。

2.3 全樣品庫與選擇性樣品庫玉米DDGS化學成分含量對EHGE估測模型的差異

在23個玉米DDGS組成的全樣品庫中，Ash、EE含量及GE與EHGE呈顯著或極顯著正相關關系(P<0.05或P<0.01)，而CP、CF、NDF含量與EHGE呈顯著或極顯負相關關系(P<0.05或P<0.01)。而由9個玉米DDGS組成的選擇性樣品庫中，CP含量與EHGE呈顯著負相關關系(P<0.05)，EE含量、GE均與EHGE呈極顯著正相關(P<0.01)，其他化學成分含量與EHGE相關性較低。由于Ash含量與EHGE呈簡單正相關關系不符合營養(yǎng)學的基本原理，因此，排除Ash后通過玉米DDGS化學成分組成對EHGE的逐步回歸分析得出，選擇性樣品庫的玉米DDGS的回歸模型(模型1)為EHGE=(3 566+53.94×EE-32.68×NDF)×4.184/1 000 (R2=0.798 1，RSD=0.43 MJ/kg)，全樣品庫的玉米DDGS的回歸模型(模型2)為EHGE=(3 742+29.67×EE-29.71×NDF)×4.184/1 000 (R2=0.535 0，RSD=0.44 MJ/kg)。2個模型中，估測因子相同。

表2 全樣品庫、選擇性樣品庫及非選擇性樣品庫中玉米DDGS的化學成分含量(干物質(zhì)基礎)

1)選擇性樣品庫和非選擇性樣品庫的方差齊次性檢驗。The test for equality of variances between selected sample pool and non-selected sample pool.

2)選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫的各化學成分含量的t檢驗統(tǒng)計量。Thet-test for chemical composition content between selected sample pool and non-selected sample pool.

圖1 第一、二主成分變量的特征向量載荷

圖2 樣品得分在第一、二主成分的載荷

簡單相關系數(shù)Simplecorrelationcoefficient酶水解物能值EHGE全樣品庫Fullsamplepool(n=23)選擇性樣品庫Selectedsamplepool(n=9)粗蛋白質(zhì)CP-0.48*-0.72*粗灰分Ash0.46*0.49粗脂肪EE0.64**0.83**粗纖維CF-0.54**-0.51中性洗滌纖維NDF-0.56**-0.42酸性洗滌纖維ADF-0.39-0.42總能GE0.47*0.85**回歸模型RegressionmodelEHGE=(3742+29.67×EE-29.71×NDF)4.184/1000EHGE=(3566+53.94×EE-32.68×NDF)×4.184/1000相關系數(shù)R20.53500.7981相對標準偏差RSD/(MJ/kg)0.440.43P值P-value0.00050.0082

*表示相關關系顯著(P<0.05)，**表示相關關系極顯著(P<0.01)。

* mean significant correlation (P<0.05), ** mean extremely significant correlation (P<0.01).

由表4可見，為了進一步比較2個EHGE估測模型的等效性，以非選擇樣品庫為對象計算各樣品的EHGE。結(jié)果表明，由模型1、2計算的EHGE平均值分別為13.68和13.61 MJ/kg，差異不顯著(P>0.05)。由模型1獲得的EHGE計算值與實測值平均相差0.47 MJ/kg。除了B24號樣品外，單個樣品相差都在0.69 MJ/kg以內(nèi)。由模型2獲得的EHGE計算值與實測值平均相差0.33 MJ/kg。除了B24號樣品外，單個樣品的計算值與實測值相差在0.62 MJ/kg以內(nèi)。模型1、2的估測標準誤(SEP)分別為0.56和0.39 MJ/kg(排除B24號樣品外，SEP=0.45和0.34 MJ/kg)。上述統(tǒng)計結(jié)果表明，2個模型在估測玉米DDGS的EHGE的準確性上是類似的。

表4 非選擇性樣品庫檢驗2個EHGE估測模型的差異

1)根據(jù)選擇性樣品庫EHGE估測模型計算得出。Calculated by EHGE prediction model of selected sample pool.

2)根據(jù)全樣品庫EHGE估測模型計算得出。Calculated by EHGE prediction model of full sample pool.

3 討 論

3.1 估測模型中定標樣品的選擇依據(jù)

在對飼料原料某一化學成分含量建立估測模型時，選擇合適的定標樣品不僅可以減少工作量，而且還能提高所建估測模型的精度和通用性[18]。在近紅外光譜法估測飼料化學成分的建模(GB/T 18868—2002)中，定標樣品的選擇或依據(jù)光譜的每一主成分得分最大值和最小值選取定標樣品，或依據(jù)光譜聚類分析后樣品間Mahalanobias距離相差0.6以上選取定標樣品[19]。該原則選擇定標樣品實質(zhì)上是根據(jù)多元統(tǒng)計分析自變量間的內(nèi)在關系以降維的手段表達樣品集所有自變量的整體變異，可以排除定標樣品庫在某一區(qū)間范圍內(nèi)樣品數(shù)量過度集中的問題。因此，從理論上是具有很好的代表性。趙峰[20]在建立鴨對玉米代謝能值的估測模型中，為了使定標樣品具有較好的代表性，在調(diào)查了427個玉米概略養(yǎng)分的基礎上，以玉米及玉米加工副產(chǎn)物擬合了30個定標樣品，并使定標樣品集在概略養(yǎng)分的正態(tài)分布上與427個玉米類似。通過該定標樣品集建立以EHGE或概略養(yǎng)分估測的代謝能模型達到了滿意的效果。然而，以該原則建立的定標樣品集雖然考慮了某一化學成分的分布概率，但未考慮樣品化學成分間的相關關系。Meloche等[21]在建立肉雞(10～18日齡)對低油玉米DDGS代謝能值的估測模型中，雖然根據(jù)樣品的EE范圍(3.15%～13.23%)選擇了15個定標樣品，但是，仍出現(xiàn)了2個樣品集中的區(qū)域(EE含量在9.6%～10.8%的樣品占6個，11%～12%的樣品占4個)。并且，通過該原則選擇樣品，并未考慮其他化學成分的變異范圍是否具有代表性。本試驗中，以EHGE作為玉米DDGS定標樣品的選擇依據(jù)，由于其與化學成分有顯著的相關性，通過控制樣品集EHGE的變異就可以間接地控制化學成分的變異。此外，從選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫化學成分的差異不顯著這一統(tǒng)計結(jié)果也表明，通過EHGE選擇的定標樣品在化學成分的差異上與未入選的樣品是類似的，從而可以排除相似性樣品進入定標樣品庫中。因此，以EHGE為指標選擇玉米DDGS的定標樣品具有可行性。

3.2 定標樣品代表性的判別

樣本的代表性指所選擇的樣本與樣本總體在化學成分含量和生物學效應等方面的相似度。一般從統(tǒng)計分析的角度比較選擇的樣品集在考察指標符合同一概率分布的前提下，平均值、方差是否與樣品總體相等來判別樣品的代表性[20]。近年來，人們通過對不同來源的樣品進行主成分分析，根據(jù)樣品在第一、二主成分得分的載荷圖直觀地表述樣品集是否出現(xiàn)分離，從而判斷哪些樣品屬于同一類或哪些是異常樣品[22-23]。因此，該方法也可以作為判斷定標樣品是否具有代表性的參考依據(jù)。本研究中，選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫在化學成分、EHGE的方差及平均值上均無顯著性差異，并且在化學成分的第一、二主成分得分載荷分布上，2個樣品庫也是重疊的。這表明，選擇性樣品庫在化學成分的含量及變異上可以代表非選擇性樣品庫，因此，可以以選擇性樣品庫作為定標樣品。在選擇性樣品庫與非選擇性樣品庫化學成分含量的內(nèi)在關系上，由選擇性樣品庫建立的化學成分含量對EHGE的估測模型與通過全樣品庫建立的化學成分對EHGE的估測模型計算的非選擇性樣品庫的EHGE無顯著性差異，這表明選擇性樣品庫化學成分與EHGE的內(nèi)在關系也可以代表非選擇性樣品庫。綜合上述3個方面，表明通過EHGE的梯度差選擇玉米DDGS定標樣品具有滿意的代表性，因此，可以此作為定標樣品庫。

4 結(jié) 論

利用玉米DDGS樣品之間EHGE相差0.21 MJ/kg左右的原則選擇的樣品組成的定標樣品庫在化學成分的含量與變異、化學成分含量與EHGE的相關性上能夠代表全樣品庫。因此，根據(jù)EHGE選擇玉米DDGS有效能估測模型中的定標樣品是可行的。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: zsummit@hotmail.com

(責任編輯 武海龍)

Method of Selecting Calibration Samples to Establish Prediction Model for Effective Energy Values of Corn Dried Distiller’s Grains with Solubles

YANG Xia1ZHAO Feng1*LI Ke2DANG Fangkun1ZHANG Hu1YIN Liting2ZHANG Hongfu1

(1.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.NewHopeLiuheCo.,Ltd.,Beijing100102,China)

The objective of this study was to investigate the rule of selecting calibration samples to establish prediction model for the effective energy of corn dried distiller’s grains with solubles (DDGS). Nine corn DDGS samples were selected from 23 corn DDGS samples (defined as full sample pool) according to the enzymatic hydrolyzate gross energy (EHGE) values with an interval of about 0.21 MJ/kg and defined as a selected sample pool. The remaining 14 corn DDGS samples were defined as a non-selected sample pool. The content and variation of chemical composition and EHGE values were compared between selected sample pool and non-selected sample pool. The regression models to predict EHGE from chemical composition were established based on full sample pool and selected sample pool, respectively. The non-selected sample pool was used to compare the values of EHGE calculated on the models based on full sample pool and selected sample pool. The results indicated that no significant difference was observed on the content of crude protein (CP), crude ash (Ash), ether extract (EE), crude fiber (CF), neutral detergent fiber (NDF) and acid detergent fiber (ADF) and EHGE between the corn DDGS from selected samples pool and non-selected pool (P>0.05). Also, no significant difference was observed on variance in CP, Ash, EE CF, NDF, ADF and EHGE between the corn DDGS from selected samples pool and non-selected pool (P>0.05). The principal component analysis showed an enormous overlapping on the score plot of principal 1 and principal 2 of selected sample pool and non-selected sample pool excluding 1 corn DDGS sample. The regression model to predict EHGE was EHGE=(3 566+53.94×EE-32.68×NDF)×4.184/1 000 (R2=0.798 1, RSD=0.43 MJ/kg) for selected sample pool and EHGE=(3 742+29.67×EE-29.71×NDF)×4.184/1 000 (R2=0.535 0, RSD=0.44 MJ/kg) for full sample pool, respectively. The mean absolute residuals of calculated value and measured value of predicted EHGE of non-selected pool (n=14) were 0.47 and 0.33 MJ/kg, respectively, and no significant difference was observed (P>0.05). In conclusion, it is practicable to use EHGE to select calibration samples for establishing prediction models of effective energy in corn DDGS.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1218-1226]

corn DDGS; enzymatic hydrolyzate gross energy; calibration samples

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.017

2016-10-01

國家自然科學基金(30901037)；新希望六和股份有限公司合作項目(QGCHT1201403240001)

楊 霞(1989—)，女，湖南懷化人，碩士研究生，從事飼料養(yǎng)分生物學效價評定的研究。E-mail: yangxia0820@qq.com

*通信作者：趙 峰，副研究員，碩士生導師，E-mail: zsummit@hotmail.com

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