張玉睿

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院 感染科， 山東 泰安 271000)

microRNA-520a與HBV相關(guān)肝細胞癌臨床病理學特征的相關(guān)性分析

張玉睿

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院 感染科， 山東 泰安 271000)

目的 旨在評估m(xù)icroRNA-520a與肝細胞癌(HCC)患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。方法 收集2010年1月-2015年12月于泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的183例HCC患者病例資料及組織標本。定量Real-time PCR檢測microRNA-520a在納入患者的HCC組織及其對應的癌旁組織中的表達水平，并分析其表達水平與HCC患者的臨床病理特征之間的關(guān)系。多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。結(jié)果 microRNA-520a在HCC組織中的表達水平，與其對應相鄰的癌旁組織相比顯著降低(1.92±0.76 vs 2.73±1.15，t=-6.731，P<0.001)。受試者工作特征曲線下面積為0.711 (95%可信區(qū)間：0.64～0.79，P<0.001)。存在遠期轉(zhuǎn)移 (P=0.031)、高臨床TNM分期(P=0.022)、血清HBV陽性(P<0.001)、存在腫瘤分隔 (P=0.026)的患者，其HCC組織中microRNA-520a的表達水平顯著降低。相關(guān)因素分析表明，microRNA-520a的表達水平與HBV感染 (r=-0.351，P<0.001)以及是否存在腫瘤分隔(r=-0.207，P=0.044)呈負相關(guān)。結(jié)論 microRNA-520a在HCC組織中的表達顯著下調(diào)，其可能抑制HCC進展。

癌, 肝細胞； 微RNAs； 病理狀態(tài), 體征和癥狀

肝細胞癌(HCC)在世界范圍內(nèi)最常見腫瘤中排名第5位，居腫瘤相關(guān)死因的第3位[1]。迄今為止，多達50%的新診斷HCC病例是由于HBV感染所致[2-4]。定期體檢、針對高危人群定期監(jiān)測均可通過常規(guī)篩查進行，而有效的早期檢測和診斷有助于提高患者生存期并改善預后。腹部超聲或結(jié)合血清AFP水平檢測在HCC診斷方面得到了廣泛認可，但是這兩種技術(shù)的診斷準確性仍然非常有限[5-7]。因此，探尋有效、簡便、快捷、高效而準確的可替代的循環(huán)或組織學指標來預測或診斷HCC的需求十分迫切[8-9]。目前，盡管諸多研究者已經(jīng)在多種人類腫瘤中探討了microRNA-520的作用機制[10-13]，但是仍然未見有關(guān)microRNA-520a在HCC中的作用及機制的相關(guān)報道。本文旨在探討microRNA-520a與HCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年1月-2015年12月于本院行手術(shù)治療的HCC患者病例資料及組織標本。所有患者診斷明確并且均為第一次接受肝切除手術(shù)治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學研究倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。病理診斷由兩位相對獨立的有多年臨床病理診斷經(jīng)驗的病理學專家完成。

1.2 組織標本的處理 收集的組織標本包括手術(shù)切除的HCC組織及其對應的相鄰癌旁肝組織。上述標本先經(jīng)福爾馬林處理，然后采取石蠟包埋。

1.3 總RNA提取及定量Real-time PCR檢測 應用瑞典Qiagen公司生產(chǎn)的miRNeasy FFPE 試劑盒(AB73504)從福爾馬林固定石蠟包埋的HCC組織及癌旁組織中提取總RNA。采用分光光度計檢測所提取到RNA的光密度(OD)值以鑒定RNA質(zhì)量，腫瘤標本OD260/280的分光光度值為1.82～2.08，癌旁組織的OD260/280的分光光度值為1.92～2.03，提示所提RNA質(zhì)量較為理想。

進一步采取定量Real-time PCR檢測HCC組織及癌旁組織中microRNA-520a的表達水平。為避免基因組DNA的污染及影響，首先采取如下措施消除基因組DNA：(1)配制混合物，即5 × gDNA Eraser緩沖液2.0 μl，1.0 μl gDNA Eraser，然后加入微量總RNA后用RNase-free H2O補充至總量10.0 μl。(2)將前述混合物保持在42 ℃ 2 min，然后在4 ℃保存待用。(3)應用美國Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司的TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(4366596)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，試劑體系為總量20.0 μl，其中包括上述去除基因組DNA的10.0 μl體系，另外再加入4.0 μl 5×PrimeScript緩沖液，1.0 μl PrimeScript RTEnzyme混合物Ⅰ，以及1.0 μl 引物混合物，最后加入4.0 μl RNase-free H2O。(4)采取定量Real-time PCR方法使用PCR7900熱循環(huán)儀(Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司)檢測microRNA水平。各檢測模板的目標序列見表1。

PCR反應體系總體積為20.0 μl，其中包括10.0 μl LightCycler 480 SYBR Green I混合物(德國，羅氏公司)，0.8 μl 正向PCR引物(10 μmol/L)，0.8 μl反向PCR引物(10 μmol/L)，1.0 μl cDNA模板(<100 ng)和7.4 μl RNase-free H2O。應用LightCycler 480(德國，羅氏公司)執(zhí)行定量Real-time PCR檢測，反應條件如下：在95 ℃下預變性5 min；95 ℃ 12 s，60 ℃ 8 s、72 ℃ 15 s為1個循環(huán)，共40個循環(huán)；溶解度曲線分析為95 ℃ 5 s、65 ℃ 60 s；最后在40 ℃下冷卻30 s。每個反應進行6次。相對mRNA表達水平microRNA-520a計算使用2-ΔΔCt方法。

表1 各檢測模板的目標序列

注：選擇RNU6B和RNU48作為內(nèi)參照以進行試驗的質(zhì)量控制

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共入組183例患者資料，其中男148例，女35例。平均58歲(23～78歲)，平均腫瘤大小5.4 cm(1～12.3 cm)?；颊吲R床及病理學特征見表2。

2.2 microRNA-520a的表達水平在HCC組織中顯著下降 通過運用RNU6B和RNU48的表達水平進行標準化后，結(jié)果提示microRNA-520a的表達水平在HCC組織中與對應的癌旁組織相比明顯減少(1.92±0.76 vs 2.73±1.15，P<0.001)(表2，圖1)。ROC曲線下面積(AUC)用于區(qū)分腫瘤和非腫瘤組織，AUC=0.711 (95%可信區(qū)間:0.64～0.79，P<0.001) (圖2)，最佳cut-off值為2.25。該結(jié)果也明確表明microRNA-520a在肝細胞癌中的表達顯著下調(diào)。

2.3 microRNA-520a的表達水平與HCC患者臨床病理特點之間的差異分析 microRNA-520a的表達水平在出現(xiàn)遠期轉(zhuǎn)移患者的HCC組織中顯著降低(P=0.031)。此外，患者存在如下因素時microRNA-520a的表達水平也顯著降低，包括高臨床TNM分期(P=0.022)、血清HBV陽性(P<0.001)、存在腫瘤分隔 (P=0.026) (表2)。

表1 HCC患者組織中microRNA-520a表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

注：VEGF，血管內(nèi)皮生長因子；MVD，微血管密度

圖1 HCC組織及對應癌旁組織定量Real-time PCR檢測microRNA-520a表達水平

圖2 區(qū)分腫瘤和非腫瘤組織的ROC曲線AUC,ROC曲線下面積

但是，在如下因素中未發(fā)現(xiàn)microRNA-520a的表達水平存在顯著差異，這些因素包括年齡、性別、組織學分化程度、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、門靜脈腫瘤栓子、HCV感染、AFP水平、肝硬化、P53、P21、VEGF以及MVD(表2)。

2.4 microRNA-520a的表達水平與HCC患者臨床病理特點之間的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示microRNA-520a的表達水平與HBV感染(r=-0.351，P<0.001)以及是否存在腫瘤分隔(r=-0.207，P=0.044)呈負相關(guān)。

3 討論

Keklikoglou等[11]發(fā)現(xiàn)microRNA-520/373家族對乳腺癌具有抑制腫瘤的效果，它是聯(lián)系TGFβ和核因子-κB通路之間的重要因素，可能導致交互炎癥、影響腫瘤轉(zhuǎn)移或進展過程。研究[12]發(fā)現(xiàn)，microRNA-520-3p通過靶向MAP3K2，抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，臨床上microRNA-520-3p可以作為非小細胞肺癌的預后標志物。Mazan-Mamczarz等[13]證明過表達microRNA-520c-3p可抑制細胞增殖及其全部基因的表達，從而促進DLBCL細胞的未成熟衰老過程。該研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-520c-3p抑制人類異種移植瘤在小鼠模型體內(nèi)的生長過程 。

HCC的發(fā)生是一個多因素參與、多步驟的復雜過程，與HBV慢性持續(xù)感染密切相關(guān)[14]。HBV慢性感染引起肝臟炎癥損傷、繼發(fā)性肝纖維化、肝細胞再生及增殖等，最終導致肝臟惡性轉(zhuǎn)化[15]。大多數(shù)HCC患者死于腫瘤快速進展相關(guān)的病程，早期診斷HCC時僅有肝切除或肝移植是有效可行的可治愈方法[16]。但是更為有效的診斷方法及其治療靶點尚不明確。已有研究[17]證實，microRNA在調(diào)節(jié)基本細胞過程中起著關(guān)鍵性作用，這些過程包括發(fā)育、增殖、細胞命運選擇及凋亡，幾乎60%的人類基因受microRNA調(diào)控。microRNA可以調(diào)控多種類型的腫瘤，其異常表達與某些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[18]，其作用機制在于microRNA異常表達時通過下調(diào)腫瘤抑制基因或癌基因的表達而促進或抑制腫瘤發(fā)生過程[19-22]。

本研究檢測了183例HBV相關(guān)HCC患者的HCC組織及對應癌旁組織中microRNA-520a的表達水平，并分析了其表達水平與患者病情及臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果提示，microRNA-520a在HCC組織中的表達顯著下調(diào)。而且，其表達水平與患者的遠期轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期、HBV陽性及腫瘤分隔相關(guān)，即在遠期轉(zhuǎn)移、和(或)高TNM分期、和(或)HBV陽性、和(或)存在腫瘤分隔的患者中其表達水平更低。這就明確提示，microRNA-520a的表達水平下降可能與患者的不良病情及預后相關(guān)。microRNA-520a的最佳cut-off值為2.25，假陽性和假陰性率分別為0.23和0.56。因此，筆者推測microRNA-520a有可能作為組合性microRNA評估指標之一，用于HCC患者的病情及預后評估。其在HCC中的作用機制目前未見報道，有待進一步地深入研究。microRNA-520a也可能成為治療HCC的新靶點，通過調(diào)控microRNA-520a的表達水平以干預HCC患者的病情進展及改善預后。

本課題組首次通過一定樣本量的實驗研究了microRNA-520a在HCC患者病理組織標本中表達水平，并證實其與HCC患者病情及預后相關(guān)，可能具有一定的臨床意義。但是，本研究仍存在一定的局限性，如實驗樣本為單中心、樣本量受限等。此外，在細胞水平及動物實驗中的研究仍在進行，包括HBV相關(guān)HCC患者的血清學檢測研究也仍需完善。

[1] FERLAY J, SHIN HR, BRAY F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010, 127(12): 2893-2917.

[2] SCHWARTZ M, ROAYAIE S, KONSTADOULAKIS M. Strategies for the management of hepatocellular carcinoma[J]. Nat Clin Pract Oncol, 2007, 4(7): 424-432.

[3] EL-SERAG HB, MARRERO JA, RUDOLPH L, et al. Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Gastroenterology, 2008, 134 (6): 1752-1763.

[4] CHO WC. OncomiRs: the discovery and progress of microRNAs in cancers[J]. Mol Cancer, 2007, 6: 60.

[5] BARTEL DP. MicroRNA: genomics, biogenesis, mechanism, and function[J]. Cell, 2004, 116 (2): 281-297.

[6] ZHANG Q, SHAN HL, XU W. Value of serum GP73, AFP, and AFP-L3 in diagnosis of liver cancer and recurrence monitoring after radiofrequency ablation[J]. J Clin Hepatol，2015， 31(2)： 232-235. (in Chinese) 張勤, 單洪麗, 續(xù)薇. 血清高爾基體糖蛋白73、甲胎蛋白及甲胎蛋白異質(zhì)體3在肝癌診斷及射頻消融術(shù)后復發(fā)監(jiān)測中的應用價值[J]. 臨床肝膽病雜志， 2015， 31(2)： 232-235.

[7] ZHAO YP, HAN XQ, XUE SB, et al. Clinical analysis of blood amino acids and trace elements in patients with hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol， 2015， 31(6)： 915-917. (in Chinese) 趙玉萍, 韓秀青, 薛書保, 等. 原發(fā)性肝癌患者血中微量元素與氨基酸濃度的變化分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2015, 31(6)： 915-917.

[8] LI G, SHEN Q, LI C, et al. Identification of circulating MicroRNAs as novel potential biomarkers for hepatocellular carcinoma detection: a systematic review and meta-analysis[J]. Clin Transl Oncol, 2015, 17(9): 684-693.

[9] BUDHU A, JIA HL, FORGUES M, et al. Identification of metastasis-related microRNAs in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2008, 47(3): 897-907.

[10] ZHANG W, LU Z, KONG G, et al. Hepatitis B virus X protein accelerates hepatocarcinogenesis with partner surviving through modulating miR-520b and HBXIP[J]. Mol Cancer, 2014, 13: 128.

[11] KEKLIKOGLOU I, KOERNER C, SCHMIDT C, et al. MicroRNA-520/373 family functions as a tumor suppressor in estrogen receptor negative breast cancer by targeting NF-κB and TGF-β signaling pathways[J]. Oncogene, 2012, 31(37): 4150-4163.

[12] YU J, TAN Q, DENG B, et al. The microRNA-520a-3p inhibits proliferation, apoptosis and metastasis by targeting MAP3K2 in non-small cell lung cancer[J]. Am J Cancer Res, 2015, 5(2): 802-811.

[13] MAZAN-MAMCZARZ K, ZHAO XF, DAI B, et al. Down-regulation of eIF4GII by miR-520c-3p represses diffuse large B cell lymphoma development[J]. PLoS Genet, 2014, 10(1): e1004105.

[14] KREMSDORF D, SOUSSAN P, PATERLINI-BRECHOT P, et al. Hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma: paradigms for viral-related human carcinogenesis[J]. Oncogene, 2006, 25(27): 3823-3833.

[15] ARBUTHNOT P, KEW M. Hepatitis B virus and hepatocellular carcinoma[J]. Int J Exp Pathol, 2001, 82(2): 77-100.

[16] BUENDIA MA, NEUVEUT C. Hepatocellular carcinoma[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2015, 5(2): a021444.

[17] LAGES E, IPAS H, GUTTIN A, et al. MicroRNAs: molecular features and role in cancer[J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2012, 17: 2508-2540.

[18] WEI X, TAN C, TANG C, et al. Epigenetic repression of miR-132 expression by the hepatitis B virus X protein in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J]. Cell Signal, 2013, 25(5): 1037-1043.

[19] CROCE CM. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer[J]. Nat Rev Genet, 2009, 10(10): 704-714.[20] HE L, THOMSON JM, HEMANN MT, et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene[J]. Nature, 2005, 435(7043): 828-833.

[21] CHEN SL, LI F, CHAI HY, et al. The expression and clinical significance of micro RNA-122 in different chronic liver diseases with HBV infection[J/CD]. Chin J Liver Dis: Electronic Edition, 2015, 9(6): 797-802. (in Chinese) 陳素玲, 李芳, 柴海云, 等. 微小RNA-122在HBV感染慢性肝臟疾病中的表達及其臨床意義[J/CD]. 中華實驗和臨床感染病雜志: 電子版, 2015, 9(6): 797-802.

[22] LI ZY, LU ZM, ZHAO XX, et al. Progress on miRNA in hepatocellular carcinoma[J/CD]. Chin J Liver Dis: Electronic Edition, 2015, 7(4): 8-10. (in Chinese) 李子英, 盧再鳴, 趙相軒, 等. 微小RNA與原發(fā)性肝癌的研究進展[J/CD]. 中國肝臟病雜志： 電子版, 2015， 7(4): 8-10. 引證本文：ZHANG YR. Correlation between microRNA-520a and clinicopathological features of HBV-related hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(4): 689-693. (in Chinese) 張玉睿. microRNA-520a與HBV相關(guān)肝細胞癌臨床病理學特征的相關(guān)性分析[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(4): 689-693.

(本文編輯：王 瑩)

Correlation between microRNA-520a and clinicopathological features of HBV-related hepatocellular carcinoma

ZHANGYurui.

(DepartmentofInfectiousDiseases,TheAffiliatedHospitalofTaishanMedicalCollege,Tai′an,Shandong271000,China)

Objective To investigate the correlation between microRNA-520a and clinicopathological parameters in patients with hepatocellular carcinoma (HCC). Methods The medical records and tissue specimens of 183 HCC patients, who received surgical treatment in the Affiliated Hospital of Taishan Medical College from January 2010 to December 2015, were collected. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of microRNA-520a in HCC tissues and corresponding adjacent tissues from 183 patients with HCC, and its correlation with clinicopathological parameters was analyzed. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the independent samplest-test was used for comparison between two groups; Spearman correlation analysis was also performed. Results HCC tissues had significantly lower expression of microRNA-520a than corresponding adjacent tissues (1.92±0.76 vs 2.73±1.15,t=-6.731,P<0.001). The area under the receiver operating characteristic (ROC) curve was 0.711 (95%CI:0.64-0.79,P<0.001). There were significant reductions in the expression of microRNA-520a in HCC tissues in patients with distant metastasis (P=0.031), advanced TNM stage (P=0.022), positive serum hepatitis B virus (HBV) (P<0.001), or tumor separation (P=0.026). The Spearman correlation analysis showed that the expression of microRNA-520a was significantly correlated with HBV infection (r=-0.351,P<0.001) and tumor separation (r=-0.207,P=0.044). Conclusion The expression of microRNA-520a is significantly downregulated in HCC tissues and it may inhibit the progression of HCC.

carcinoma, hepatocellular; microRNAs; pathological conditions, signs and symptoms

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.04.018

2016-10-31；

2016-11-22。

張玉睿(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事病毒性肝炎及肝癌的基礎(chǔ)與臨床研究。

R735.7

A

1001-5256(2017)04-0689-05