韓嘯 張競競 韓正全

miRNA-Let-7b調(diào)控胃癌順鉑耐藥性的機(jī)制研究

韓嘯 張競競 韓正全

目的 探究miRNA-Let-7b調(diào)控胃癌細(xì)胞順鉑化療耐藥的分子機(jī)理。方法 將胃癌細(xì)胞系SGC-7901耐藥株作為研究對(duì)象，采用RT-PCR法對(duì)miRNA-Let-7b在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，對(duì)細(xì)胞存活情況、轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖情況及凋亡情況進(jìn)行綜合分析。結(jié)果 SGC-7901/DDP細(xì)胞miRNA-Let-7b表達(dá)水平是SGC-7901的（27．37±2．84）%（P＜0．05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SGC-7901轉(zhuǎn)染Let-7b inhibitor后對(duì)順鉑的敏感性降低（P＜0．05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SGC-7901轉(zhuǎn)染miRNA-Let-7b minmic后對(duì)順鉑的敏感性則得到了增強(qiáng)（P＜0．05）；SGC-7901轉(zhuǎn)染miRNA-Let-7b mimic后，細(xì)胞凋亡率增強(qiáng)，高于對(duì)照組（P＜0．05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 miRNA-Let-7b表達(dá)水平的降低能夠在一定程度上加快胃癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，使胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感度降低，為臨床抗癌藥物的研發(fā)提供參考。

miRNA-Let-7b；胃癌細(xì)胞；順鉑；耐藥性；分子機(jī)理

作為臨床中一種極為常見的消化道腫瘤疾病，胃癌具有較高的發(fā)病率與死亡率，嚴(yán)重威脅著人們的生命安全。通常胃癌患者在就醫(yī)時(shí)已發(fā)展成為晚期，多采用化療治療。當(dāng)前臨床中對(duì)胃癌的化療治療效果并不理想，這很大程度上是由于胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性造成的[1-2]。此次研究探究了miRNALet-7b調(diào)控胃癌細(xì)胞順鉑化療耐藥的分子機(jī)理，并對(duì)研究結(jié)果做出相應(yīng)總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

此次研究所采用的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901細(xì)胞株由上海澤葉生物科技有限公司提供，順鉑DDP由云南生物谷藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用10%滅活胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)液對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901及耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP于5%CO2、37℃環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，飽和濕度為85%，并選擇處于指數(shù)期生長細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.2.2 細(xì)胞RNA提取及完整性檢測 將SGC-7901及SGC-7901/DDP分別接種于培養(yǎng)瓶，在其中加入5 ml RPMI1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到85%融合生長，對(duì)總RNA進(jìn)行Trizol試劑提取。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析轉(zhuǎn)染前后SGC-7901及SGC-7901/DDP細(xì)胞miRNA-Let-7b的表達(dá)水平，并進(jìn)行驗(yàn)證，做好相應(yīng)的記錄。

1.2.4 轉(zhuǎn)染效率測試 采用lipofectamineRNAimax對(duì)miRNALet-7b抑制物及陰性對(duì)照NC進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心收集，在4℃環(huán)境下，采用PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行兩次洗滌，除去上清液?；旌暇鶆颍诒芄鈼l件下孵育20 min左右，采用流式細(xì)胞以對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，并采用Mod-FitLTV3.0軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞株miRNA-Let-7b轉(zhuǎn)染前后表達(dá)水平檢測

轉(zhuǎn)染前，miRNA-Let-7b在SGC-7901/DDP細(xì)胞中的表達(dá)水平低于在SGC-7901細(xì)胞中的水平，是SGC-7901細(xì)胞的（27.37±2.84）%（P＜0.05），轉(zhuǎn)染48 h后，SGC-7901/DDP細(xì)胞miRNA-Let-7b表達(dá)水平是SGC-7901的（19.92±1.64）%，見圖1。

圖1 miRNA-Let-7b在SGC-7901細(xì)胞株及SGC-7901/DDP細(xì)胞中的起始表達(dá)量

2.2 miRNA-Let-7b對(duì)細(xì)胞順鉑藥物敏感性的影響

SGC-7901轉(zhuǎn)染Let-7b inhibitor后對(duì)順鉑的敏感性降低，細(xì)胞TC50值為0.604 μg/ml，95%可信區(qū)間為0.462～0.784 μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SGC-7901轉(zhuǎn)染miRNA-Let-7b minmic后對(duì)順鉑的敏感性則得到了增強(qiáng)（P＜0.05），細(xì)胞TC50值為4.482 μg/ml，95%可信區(qū)間為4.052～4.763 μg/ml，見圖2。

2.3 miRNA-Let-7b對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

SGC-7901轉(zhuǎn)染miRNA-Let-7b mimic后，SGC-7901/DDP為（13.52±0.362），細(xì)胞凋亡率增強(qiáng)，高于對(duì)照組的（3.654±0.153），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

臨床研究表明，對(duì)于胃癌晚期患者給予含鉑雙藥標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療總有效率僅為30%左右[3-4]，這很大程度上是因?yàn)榛颊邔?duì)化療藥物的原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥作用，因此，對(duì)鉑類藥物治療敏感性的識(shí)別與抑制研究尤為重要。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織及細(xì)胞內(nèi)存在一定數(shù)量的miRNA表達(dá)異常，其在基因轉(zhuǎn)錄后會(huì)對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞凋亡通路異常[5]。此次研究中著重探究了miRNA-Let-7b調(diào)控胃癌細(xì)胞順鉑化療耐藥的分子機(jī)理，結(jié)果顯示，SGC-7901轉(zhuǎn)染Let-7binhibitor后對(duì)順鉑的敏感性降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SGC-7901轉(zhuǎn)染miRNA-Let-7b minmic后對(duì)順鉑的敏感性則得到了增強(qiáng)（P＜0.05），說明miRNA-Let-7b在胃癌細(xì)胞中能夠充當(dāng)抑癌基因作用，其低表達(dá)會(huì)降低SGC-7901對(duì)順鉑的敏感性，相反，其高表達(dá)則會(huì)在一定程度上增強(qiáng)SGC-7901對(duì)順鉑的敏感性。另外，SGC-7901轉(zhuǎn)染miRNA-Let-7b mimic后，細(xì)胞凋亡率明顯增強(qiáng)，高于對(duì)照組（P＜0.05）。作為一種抑癌基因，miRNA-Let-7b能夠?qū)?xì)胞增殖起到抑制作用，其表達(dá)水平變化直接影響到細(xì)胞凋亡及對(duì)順鉑的敏感性[6-8]。

綜上所述，miRNA-Let-7b對(duì)胃癌細(xì)胞順鉑化療耐藥性具有調(diào)控作用，能夠?qū)?xì)胞增殖起到抑制作用，可以為臨床抗癌藥物研發(fā)提供借鑒。

圖2 miRNA-Let-7b對(duì)細(xì)胞順鉑藥物敏感性的影響

[1] 鄭曉輝，劉平． MiR-497對(duì)人胃癌細(xì)胞株順鉑耐藥性的影響和機(jī)制[J]． 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36（3）：191-195．

[2] 張芳，李洋，吳蘅，等． MiR-192靶向負(fù)調(diào)控Bim表達(dá)誘導(dǎo)肺癌順鉑耐藥[J]． 中國肺癌雜志，2014，17（5）：384-390．

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[4] 莫益俊，李道傳，傅文凡，等． 非小細(xì)胞肺癌順鉑化療耐藥相關(guān)微RNA的篩選及鑒定[J]． 腫瘤研究與臨床，2013，25（3）：160-165．

[5] 牛秀瓏，陳曉，張曉雷，等． 內(nèi)源性IL-8誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑與紫杉醇產(chǎn)生耐藥的機(jī)制研究[J]． 免疫學(xué)雜志，2012，28（8）：645-650．

[6] 任麗，黃琛，柳雅慧，等． 微小RNA-21轉(zhuǎn)染對(duì)人肺癌細(xì)胞株順鉑耐藥性的影響及機(jī)制探討[J]． 中華醫(yī)學(xué)雜志，2016，96（18）：1454-1458．

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[8] 李濱，汪麗燕，蔣歡歡． Periostin過表達(dá)誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞化療耐藥性的機(jī)制研究[J]． 胃腸病學(xué)，2013，18（12）：728-732．

Molecular Mechanism of miRNA-Let-7b Regulating Chemotherapy Resistance in Cisplatin of Gastric Cancer Cells

HAN Xiao ZHANG Jingjing HAN Zhengquan Internal Medicine-

Oncology Department, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233000, China

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism of miRNA-Let-7b regulating chemotherapeutic drug resistance in cisplatin of gastric cancer cells.MethodsThe expression of miRNA-Let-7b was detected by RT-PCR in gastric cancer cell line SGC-7901, and the expression of miRNA-Let-7b in gastric cancer cells was detected. The cell proliferation, The situation of the comprehensive analysis. Results The expression level of miRNA-Let-7b in SGC-7901 / DDP cells was (27.37 ± 2.84)% (P ＜ 0.05), which was statistically significant. SGC-7901 transfected with Let-7b inhibitor (P ＜ 0.05). The sensitivity of SGC-7901 transfected miRNA-Let-7b minmic to cisplatin was significantly increased (P ＜ 0.05); SGC-7901 transfected miRNA The apoptosis rate was significantly higher than that of the control group (P＜ 0.05), and the apoptosis rate was significantly higher than that of the control group (P ＜ 0.05).ConclusionThe decrease of miRNA-Let-7b expression can accelerate the proliferation of gastric cancer cells and inhibit the apoptosis of gastric cancer cells, and reduce the sensitivity of gastric cancer cells to cisplatin, which can provide reference for the development of clinical anticancer drugs.

miRNA-Let-7b; gastric cancer cell; cisplatin; drug resistance; molecular mechanism

735．2；R730．53

A

1674-9316（2017）06-0064-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．06．038

miRNA-let-7b逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥性的作用及分子機(jī)制研究（課題編號(hào)1608085MH201）

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000

韓正全