宋慶宏，江 濤

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因修飾內(nèi)皮祖細胞移植對大鼠肢體缺血的實驗研究

宋慶宏1，江 濤2

目的：探討人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）修飾的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)移植對SD大鼠缺血肢體治療機制和規(guī)律。

內(nèi)皮祖細胞；移植；缺血；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；大鼠

自2002年Tateishi等學(xué)者將自體骨髓干細胞移植和自體外周血干細胞移植治療下肢缺血[1]，取得成功以來，采用干細胞移植治療肢體缺血逐漸成為研究的熱點問題。近些年來國內(nèi)外已有多項研究表明干細胞移植治療下肢缺血可以取得較好療效[2-4]。內(nèi)皮祖細胞 (endothelial progenitor cells,EPCs)分泌的相關(guān)因子是促血管形成較強的因子，EPCs的研究發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了治療血管新生的時代[5-7]。實驗研究表明，EPCs可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱和肌肉等多種中胚層細胞，能夠促進多種活體病損組織的修復(fù)，且EPCs具有分離、增值潛能高，穩(wěn)定性較好等優(yōu)點[8-10]。本研究基于EPCs的這些優(yōu)點，采用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）修飾EPCs，探討hTERT修飾后的EPCs對SD大鼠缺血肢體的治療機制和規(guī)律，為優(yōu)化EPCs移植治療肢體缺血提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要試劑、儀器 清潔級SD大鼠64只，雌雄各半，體質(zhì)量為250～310 g，實驗中對動物處置方法符合動物倫理學(xué)要求。DMEM/F12培養(yǎng)基、質(zhì)量百分比為5%胎牛血清(FBS)(美國Gibco BRL公司)；PKH-26、谷氨酞胺(Sigma公司)；25%胰蛋白酶(GibcoBRL公司)；LipofectamineTM2000、Trizol(Invitrogen公司)：RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾康生物技術(shù)有限公司)；Taq酶（加拿大BBI公司產(chǎn)品）；dNT(TaKaRa公司)；Western blot化學(xué)發(fā)光試劑(Santa cruz公司)；兔抗人hTERT抗體、HRP一羊抗兔IgG，PVDF膜(Pierce公司)；5 μL微量注射器(Hamilton，美國)；主要實驗儀器有二氧化碳培養(yǎng)箱(RS Biotech公司，英國)、熒光倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)及超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)等。

1.2 EPCs的制備、鑒定及標記 采用腹腔注射法對各組大鼠行麻醉處理，皮膚經(jīng)消毒后，依序切開皮膚、皮下肌肉，直至暴露出股骨和脛骨，并取出股骨和脛骨，將骨頭的干骺端去掉，使骨髓腔其充分的顯露，吸取少量的淋巴細胞分離液對骨髓腔行多次沖洗，將沖洗液收集到試管后備用，離心后分離出單個核細胞：取潔凈離心管一只，將大鼠的淋巴細胞通過用注射器分離液6 mL注入離心管，然后加入6 mL的細胞懸液，將離心管置于離心機后，以離心機轉(zhuǎn)數(shù)為2500 r/min，離心25 min，進行離心，離心完畢后將其取出，用事先準備好的PBS進行細胞沖洗，共進行2次；再次將離心管置入離心機中，調(diào)整離心機參數(shù)為1500 r/min，10 min，進行離心，畢后取出離心管，吸上清液并棄去，向離心管中加入EGM-2 MV完全培養(yǎng)基，用膠頭滴管對其反復(fù)進行吹打直至將細胞沉淀吹打至懸浮狀態(tài)為止，吸取少量細胞懸液將其接種到培養(yǎng)皿中，接種密度為1×106/m，接種完畢將其置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，至第4 d末進行培養(yǎng)液的更換，同時將未貼壁的細胞一同丟棄，此后每3 d進行一次培養(yǎng)液的更換，當細胞貼壁為80%后時，通過胰酶消化，以1∶2～1∶3的比例進行傳代。流式細胞儀檢測細胞表面CD133、VEGFR-2和vWF的表達。吸取PKH-26液5 μL至1.5 mL的EP管中，加入1 mL完全培養(yǎng)液，吹打均勻，即得PKH-26標記液。PKH-26標記效果在熒光顯微鏡下觀察。標記率=視野內(nèi)陽性細胞總數(shù)/視野內(nèi)細胞總數(shù)×100%。

1.3 PLXSN-hTERT轉(zhuǎn)染及體外檢測 取生長良好的第四代EPCs，培養(yǎng)在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置飽和濕度5%CO2，37℃恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d傳代1次，于實驗時取對數(shù)生長期的細胞，按6×104個/孔將EPCs接種于24孔板中，PLXSN-hTERT轉(zhuǎn)染需在3 d后進行，用PBS洗滌兩次，細胞培養(yǎng)面積的完全覆蓋需要根據(jù)感染倍數(shù)(multiple infection,MOI)=105稀釋的PLXSN-hTERT。在37℃恒溫下孵育2 h，加入胎牛血清和L-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培育1周后進行下列實驗。PLXSN-hTERT轉(zhuǎn)染即分為3組：對照組、空載病毒組、hTERT轉(zhuǎn)染組。總蛋白在經(jīng)離心后的細胞懸液收集目的細胞提取，Bradford法測定蛋白的濃度，Quantity one圖像分析3次試驗。

1.4 EPCs的PKH-26標記 將5 μL PKH-26液吸取至1.5 mL的EP管后，加入1 mL完全培養(yǎng)液，均勻吹打后，即得PKH-26標記液。用PBS洗3次貼壁達90%吸棄培養(yǎng)液的融合細胞，加入PKH-26標記液，于37℃飽條件下，濕度恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min，吸棄標記液，加入5 mL的培養(yǎng)液孵育10 min后吸棄，重復(fù)清洗2次。在熒光顯微鏡下觀察PKH-26標記后的效果。選取5個隨機視野，PKH-26陽性細胞計數(shù)，計算標記率。標記率=視野內(nèi)陽性細胞總數(shù)/視野內(nèi)細胞總數(shù)×100%，將終濃度調(diào)為1×1010/L備用。

1.5 動物模型的制備及骨髓細胞移植 SD大鼠以200 g/L的烏拉坦按1.2 g/kg經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉后，自其左腹股溝韌帶至膝關(guān)節(jié)上下行一縱行切口，分別結(jié)扎股動脈及分支，以微量加樣器自結(jié)扎處以下2 cm開始，以每0.2 cm為一注射點，于內(nèi)收肌和腓腸肌共注射5點，每注射點各注射60 μL，缺血對照組為300 μL培養(yǎng)液，hTERT治療組大鼠注射含5 μg基因pcDNA3-hTERT的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，EPCs治療組大鼠注射3×106個EPCs，轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組大鼠注射含3×106個hTERT基因的EPCs。觀察5 min，如無異常，逐層關(guān)閉切口。

1.6 動脈造影及毛細血管密度的測定 ⑴動脈造影：于術(shù)后4周在實驗動物的穿刺腹主動脈推注70%泛影葡胺2 mL，行DSA。⑵毛細血管密度的測定：取左側(cè)腓腸肌組織制作石蠟切片，利用小鼠抗大鼠Ⅷ因子抗體(1∶50，NeoMaker Biotech)和山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體(北京中杉生物技術(shù)公司)行免疫組織化學(xué)染色。每個標本隨機取20個視野，在高倍鏡(400倍)下計算新生血管數(shù)量及熒光顯微鏡觀察計算每個視野中的PKH-26陽性細胞數(shù)，取其均值作為各組的PKH-26陽性細胞數(shù)。

1.7 RT-PCR檢測hTERT基因的體內(nèi)表達 用液氮將各組大鼠移植區(qū)組織磨成粉末,加Trizol，振蕩混勻，離心5 min。將上清液(約450 μL)加入150 μL無水乙醇，混勻并全部轉(zhuǎn)移到UNQ-10柱里離心，收集管內(nèi)的RNA樣品,可立即使用或者-70℃保存。按Reverse Transcription system Kit說明合成cDNA。PCR引物根據(jù)Genbank中登錄的hTERT cDNA全長序列設(shè)計兩對引物，擴增hTERT cDNA全長序列上游引物：5'-ATGAATTCATGGGGGTGCACGAATGTCC-37，下游引物：5'-GCCTCGAGTCATCTGT CCCCTG TCCTGC-3’，預(yù)期擴增片段長582 bp。RT-PCR法鑒定hTERT在各組中表達的上游引物為：5'-TCATCTGTGACAGCCGAGTC-3’下游引物為5'-CACTGACGGCTTTATCCACA-3’，預(yù)期擴增片段長288 bp。β-actin上游引物為5-AGA GGGAAATCGTGCGTGAC-3，下游引物為5-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，產(chǎn)物大小224 bp；均由上海生工生物工程公司合成．PCR反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min后行30個循環(huán)，每循環(huán)95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照，再經(jīng)圖像分析系統(tǒng)進行電泳條帶的掃描分析。hTERT mRNA的含量依據(jù)PCR擴增條帶掃描密度和hTERT待測PCR擴增條帶的掃描密度推斷。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞形態(tài) 培養(yǎng)4～5 d后，有絲分裂長梭形或多角形細胞明顯增多；培養(yǎng)8～9 d，呈單層的漩渦狀或輻射狀生長細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面(圖1A)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示CD29，CD49，CD90，CD105和HLA-1陽性，內(nèi)皮祖細胞均一性好，純度達96%以上(圖1B)。

圖1 EPCs的形態(tài)觀察（×200）

2.2 內(nèi)皮祖細胞免疫表型的鑒定 貼壁細胞均高表達內(nèi)皮祖細胞表型CD29，CD90，CD49，CD105和HLA-1，不表達或低表達造血細胞表型CD34，CD45，低表達內(nèi)皮細胞表型CD31。24 h時，PKH-26標記的EPCs在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，F(xiàn)CM檢測細胞標記率達100%。

2.3 外源hTERT基因在人EPCs中的表達 Western blot鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3-hTERT后的人EPCs中能夠檢測到hTERT蛋白的表達(圖2)，其蛋白條帶位置(34 KDa)與陽性對照即人胎肝細胞L02一致，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人EPCs中無hTERT蛋白的表達。

圖2 hTERT基因在人EPCs中hTERT蛋白的電泳表達

2.4 大鼠動脈造影 大鼠動脈造影結(jié)果見圖3。缺血對照組股動脈及其分支均未顯影；hTERT治療組和EPCs治療組可見中等量新生血管，兩組效果相似；轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組可見有大量新生血管新生，豐富的側(cè)枝循環(huán)建立。

2.5 熒光顯微鏡觀察測定結(jié)果 熒光顯微鏡在高倍鏡(200倍)觀察結(jié)果顯示大鼠腓腸肌組織制作石蠟切片中的PKH-26陽性細胞數(shù)：缺血對照組為（0±0.00）個/HP，hTERT治療組為（0±0.00）個/HP，EPCs組為（27.46±5.48）個/HP，轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組為（54.37±8.34）個/HP，各組之間差異顯著（P＜0.05），見圖4。

圖3 大鼠動脈造影結(jié)果

圖4 4周后各組大鼠腓腸肌組織中的PKH-26陽性細胞數(shù)（免疫熒光，×200）

2.6 RT-PCR檢測大鼠hTERT基因的體內(nèi)表達

hTERT mRNA特異引物擴增(見圖5)，結(jié)果為：轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組和hTERT治療組均有擴增，其中轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組表達高于hTERT治療組，其hTERT mRNA相對含量分別為（0.89±0.06）、（0.29±0.04）(P＜0.05)。

3 討論

近年干細胞移植與基因治療聯(lián)合，促進移植細胞的定向分化及提高移植療效的研究得到了廣泛的重視。內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPCs)是一類能夠進入循環(huán)、增殖并分化為成熟血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，具有不斷更新的多分化潛能。一方面EPCs有促進組織器官尤其是缺血組織器官的微血管修復(fù)，對胚胎時期及出生后成體的血管生成中起到重要作用。另一方面，EPCs本身也可以分泌一些細胞因子像血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、bFGF等，這些因子會由于旁分泌效應(yīng)對內(nèi)皮細胞的增殖及血管修復(fù)起到積極作用，也就是血管生成增強效應(yīng)，這樣使血供也得到了改善。EPCs發(fā)揮作用的前提是細胞的歸巢，即組織損傷促進釋放一些信號分子，移植的EPCs會發(fā)生定向趨化遷移，在損傷部位發(fā)揮修復(fù)和再生的作用。有近年干細胞移植聯(lián)合基因治療，促進移植細胞的定向分化及提高移植療效的研究越來越受重視[11]。hTERT是一個新的神經(jīng)遞質(zhì)，它及其受體廣泛分布于人與動物的大腦中，其能以自分泌或旁分泌的方式，結(jié)合細胞表面特異性的細胞受體端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶受體來發(fā)揮作用[12]。有研究表明[13]，當肢體缺血發(fā)生后，hTERT可抑制自由基鏈式反應(yīng)，降低多種內(nèi)源性致傷因子對缺血區(qū)的損傷，改善細胞內(nèi)Ca超載，并可通過兩種相互作用的通道明顯的抑制缺血、缺氧性損傷后的細胞凋亡。有研究報道在人和鼠的肢體發(fā)生缺血、缺氧性損傷后，內(nèi)源性hTERT-R表達明顯上調(diào)進而發(fā)揮保護作用，而外源性hTERT可使其保護作用增強[14-15]。本研究將攜帶端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因的pcDNA3-hTERT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人EPCs，移植到大鼠缺血模型下肢，以期促進EPCs的增值、遷延、分化以及引導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞歸巢，促進新生血管形成，改善肢體缺血狀況。

圖5 各組大鼠hTERT基因的電泳表達

研究結(jié)果顯示，本組64只大鼠均造模成功，并進入結(jié)果分析。通過Western blot檢測顯示轉(zhuǎn)染人hTERT基因的人內(nèi)皮祖細胞體外能表達hTERT。通過動脈造影觀察到移植后4周，缺血對照組大鼠股動脈及其分支均未顯影，hTERT治療組和EPCs治療組可見中等量新生血管，兩組效果相似，轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組治療組能夠觀察到大量新生血管新生以及豐富的側(cè)枝的循環(huán)建立。通過檢測大鼠毛細血管密度發(fā)現(xiàn)，hTERT治療組和EPCs治療組均較缺血對照組新生血管數(shù)量增加，轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組可進一步增強療效，hTERT治療組和EPCs治療組兩組之間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。通過熒光顯微鏡觀察到PKH-26標記的EPCs存活情況可見，轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組PKH-26陽性細胞數(shù)明顯增加。通過RT-PCR檢測顯示，轉(zhuǎn)染 hTERT基因的EPCs治療組和hTERT治療組均有擴增，轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組hTERT mRNA相對含量表達高于hTERT治療組。結(jié)果提示hTERT及EPCs單獨治療組可以促新生血管形成，而將hTERT修飾后的EPCs治療大鼠肢體缺血后對新生血管的形成更進一步加強。本研究結(jié)果表明hTERT基因修飾的EPCs移植對大鼠肢體缺血具有保護作用，能進一步提高EPCs移植對治療肢體缺血的效果，可為肢體缺血的治療提供了新的實驗依據(jù)。

綜上所述，EPCs移植是治療肢體缺血的新的治療手段，動物實驗及臨床實驗研究均表明其具有相當可觀的前景。我們的研究結(jié)果證明了EPCs作為種子細胞可為肢體缺血疾病的治療發(fā)揮可觀作用。但目前關(guān)于干細胞基因治療肢體缺血性疾病的研究尚處在初期階段，且其具體作用機制及安全性等問題還有待于在今后的深人研究中解決。未來的研究中設(shè)想將干細胞移植、細胞因子、基因治療與常規(guī)治療聯(lián)合應(yīng)用，可能會擁有更廣闊的應(yīng)用前景。我們相信在不久的將來EPCs移植治療肢體缺血將在臨床上廣為開展。

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（收稿：2016-01-26 修回：2016-05-20）

（責(zé)任編輯 王 豐）

Experimental Study on the Effect of Human Telomerase Reverse Transcriptase Gene Modified Endothe-lial Progenitor Cells Transplantation on Limb Ischemia in Rats

SONG Qing-hong,JIANG Tao
Depart-ment of Vascular Surgery,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin(300190),China

Objective To investigate the mechanism and regulation of hTERT modified endothelial progenitor cells(EPCs)transplantation on ischemic limb of SD rats. Methods EPCs were cultured and identified after Lipofectamine stably transfected PLXSN-hTERT EPCs expression by Western blot identification of exogenous human hTERT gene in endothelial progenitor cells.Sixty-four male SD rats were randomly divided into 4 groups：A,B,C and D.Each group had a total of 16 rats.After ligation of the femoral artery and branches of the left hind limbs,the hind limb ischemia model was constructed,the adductor and gastrocnemius muscle were injected 5 points,each point injection 60 L.A group rats were injected with 300 L medium,B group rats were injected with 5 g of PLXSN-hTERT gene DNA-liposome complexes,C group rats were injected with 4×106EPCs,and D group rats were injected with 4×106 hTERT gene EPCs.RT-PCR angiography was performed to detect the expression of hTERT gene and neovascularization in 4 weeks after transplantation,and the survival of PKH-26 labeled EPCs was evaluated by fluorescence microscope. Results All of the 64 rats were successfully constructed,and the results of Western blot showed that human endothelial progenitor cells transfected with human hTERT gene could express hTERT in vitro 4 weeks after transplantation and angiography.A group rat femoral artery and its branches were not visualized,B group and C group showed moderate neovascularization(effects of the two groups were similar),D group can further enhance the effect.The number of PKH-26 positive cells were：[A,B,C and D four groups(0±0.00)，(0±0.00)，(27.46±5.48)，(54.37±8.34)/HP,P＜0.05].In vivo expression of hTERT gene in RT-PCR,D group and B group were transfected with hTERT gene amplification, hTERT mRNA relative content of D group was higher in B group(0.89±0.06,0.29±0.04,P＜0.05). Conclusion Using Htert modified EPCs transplantation to treat limb ischemia in rats,can make hTERT gene stable and effective expression,and its effect is better than the direct gene injection.

Endothelial progenitor cells;transplantation;ischemia;telomerase reverse transcriptase;rat

Q95-33；R654.4

A

1007-6948(2017)02-0155-06

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.02.014

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)（天津 300100）

2.天津市人民醫(yī)院普外科（天津 300121）

江濤,E-mail：642403512@qq.com

方法：EPCs原代培養(yǎng)及鑒定后，脂質(zhì)體法將PLXSN-hTERT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EPCs，Western blot鑒定外源hTERT基因在內(nèi)皮祖細胞中的表達。64只雄性SD大鼠隨機單位組設(shè)計分為4組：缺血對照組（A組）、hTERT治療組（B組）、EPCs治療組（C組）、轉(zhuǎn)染hTERT基因的EPCs治療組（D組）,每組16只。結(jié)扎大鼠左股動脈及分支，構(gòu)建后肢缺血模型。于內(nèi)收肌和腓腸肌共注射5點，每點注射60 μL，A組注射300 μL培養(yǎng)液，B組注射DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，C組注射4×106個EPCs，D組注射4×106個含hTERT基因的EPCs。于移植后4周行動脈造影，采用RT-PCR檢測hTERT基因的體內(nèi)表達，評價血管新生情況；熒光顯微鏡觀察PKH-26標記的EPCs存活情況。結(jié)果：64只大鼠均造模成功。Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染人hTERT基因的人內(nèi)皮祖細胞體外能表達hTERT。移植后4周動脈造影顯示，A組大鼠股動脈及其分支均未顯影，B組和C組可見中等量新生血管，兩組效果相似，C組可見有大量新生血管及豐富的側(cè)枝循環(huán)建立。B組和C組均較A組新生血管數(shù)量增加，D組可進一步增強療效PKH-26陽性細胞數(shù)：ABCD四組分別為[(0±0.00)，(0±0.00)，(27.46±5.48)，(54.37±8.34)]個/HP；P＜0.05。RT-PCR檢測hTERT基因的體內(nèi)表達，D組和B組均有擴增，D組hTERT mRNA相對含量高于B組。D組和B組hTERT mRNA相對含量分別為(0.89±0.06,0.29±0.04；P＜0.05)。結(jié)論:通過人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）修飾的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)移植治療大鼠肢體缺血，可以讓hTERT基因穩(wěn)定有效持續(xù)的表達，其效果優(yōu)于直接基因注射。