張春霆，朱再生

凋亡抑制蛋白和緊密連接蛋白4在前列腺癌中的表達(dá)及與前列腺癌臨床病理特征的關(guān)系

張春霆，朱再生

目的:探討凋亡抑制蛋白（Livin）和緊密連接蛋白-4（Claudin-4）在前列腺癌中的表達(dá)及其與前列腺癌中病理特征的相關(guān)性。方法:采用組織芯片技術(shù)，構(gòu)建64點(diǎn)陣組織芯片，對(duì)71例前列腺癌和37例前列腺增生組織進(jìn)行檢測(cè)，免疫組化SP法檢測(cè)Livin和Claudin-4蛋白的表達(dá)，并與前列腺癌的臨床病理關(guān)系進(jìn)行分析；Spearman等級(jí)相關(guān)法分析Livin和Claudin-4表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:Livin蛋白和Claudin-4蛋白在前列腺增生組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于前列腺癌組織(P＜0.01)。Livin在39例前列腺癌＜7分和≥7分的陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.41%（22/39）和81.25%（26/32），兩者之間比較有差異；在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.10%（23/41）和83.33%（25/30），兩者相比有明顯差異。Claudin-4在＜7分和≥7分的陽(yáng)性表達(dá)率為43.59%（17/39）和75.00%（24/32），兩者之間比較有差異；在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.98%（25/ 41）和80.00%（24/30），兩者比較有明顯差異。Livin和Claudin-4蛋白表達(dá)狀況Spearman相關(guān)分析顯示呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r= 0.87。結(jié)論:Livin和Claudin-4蛋白異常表達(dá)可能與了前列腺癌的發(fā)生、進(jìn)展，聯(lián)合檢測(cè)可能提高前列腺癌患者的預(yù)后評(píng)估。

前列腺癌；凋亡抑制蛋白；緊密連接蛋白-4；組織芯片；免疫組織化學(xué)

前列腺癌已成為危害我國(guó)男性健康的疾病之一[1]，前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)，其中凋亡抑制調(diào)節(jié)紊亂及相關(guān)基因表達(dá)異?？赡軈⑴c其中。研究發(fā)現(xiàn)Livin和Claudin-4的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[2-3]。本研究采用組織芯片技術(shù)檢測(cè)浙江大學(xué)金華醫(yī)院泌尿外科2001年6月—2011年6月病理組織庫(kù)標(biāo)本71例前列腺癌和37例前列腺增生組織Livin和Claudin-4蛋白的表達(dá)，分析Livin和Claudin-4在前列腺癌中的表達(dá)狀況及相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 本組共71例，患者年齡55～82歲，平均（67.5±8.5）歲。前列腺癌根據(jù)Gleason評(píng)分系統(tǒng)，Gleason評(píng)分＜7分的39例，Gleason評(píng)分≥7分的32例，臨床分期按照2002年AJCC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期30例。取標(biāo)本前均未接受放療、化療和內(nèi)分泌治療。37例前列腺增生組織，取自同期非腫瘤，年齡56～79歲，平均年齡（66± 9）歲，前列腺增生患者無(wú)其他部位腫瘤發(fā)現(xiàn)。

1.2 方法 構(gòu)建8×8點(diǎn)陣的組織芯片4個(gè)，2個(gè)用于免疫組化染色，2個(gè)用于陰性對(duì)照。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，連續(xù)3 μm切片，制成芯片的所有組織（DAB顯色劑和SP試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司）每例前列腺癌和增生組織標(biāo)本各取1個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)陣后標(biāo)記，點(diǎn)陣儀對(duì)標(biāo)記完成組織打點(diǎn)取樣，固定于多聚賴(lài)氨酸載玻片上，烤片6 h，制作完成。按說(shuō)明書(shū)行免疫組化，所有癌和前列腺組織常規(guī)切片后二甲苯進(jìn)行脫蠟，梯度乙醇依次水化。加入兔抗人Livin單抗(濃度1∶100)和Claudin-4單克隆抗體（1∶50），4℃孵育過(guò)夜，PBS×3次，每次5 min；滴加二抗(生物素標(biāo)記)室溫孵育30 min；PBS×3次，每次5 min；后經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片、光鏡觀察，用PBS緩沖液代替Livin和Claudin-4一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 Livin蛋白主要定位于細(xì)胞漿，陽(yáng)性細(xì)胞為免疫組化染色胞漿呈現(xiàn)藍(lán)褐色顆粒，細(xì)胞膜和細(xì)胞核極少。Claudin-4陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒；結(jié)果判定參照Sulzers表達(dá)分級(jí)法；由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行判斷，根據(jù)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)：（-）為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜10%為（+），陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)10%～50%為（++），陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞50%為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，成組設(shè)計(jì)率的比較行χ2檢驗(yàn)（或四格表Fisher概率法），Spearman行相關(guān)性分析，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Livin和Claudin-4在前列腺癌組織中的表達(dá)位置 Livin主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，而在胞膜及胞核中表達(dá)不明顯，Claudin-4主要主要表達(dá)在細(xì)胞膜（見(jiàn)圖1）。

圖1 Claudin-4和Livin在前列腺癌中的表達(dá)（sp法×400）

2.2 Livin和Claudin-4表達(dá)與Gleason分級(jí)和臨床分期的關(guān)系 Livin在39例前列腺癌＜7分的陽(yáng)性表達(dá)率為56.41%（22/39），Livin在32例前列腺癌≥7分的表達(dá)率為81.25%（26/32），兩者之間比較有差異；在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.10%（23/41）和83.33%（25/30），兩者相比有明顯差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Claudin-4在＜7分的陽(yáng)性表達(dá)率為43.59%（17/39），在≥7分的表達(dá)率為75.00%（24/ 32），兩者之間比較有差異；在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率為表達(dá)率分別為60.98%（25/41）和80.00%（24/30），兩者比較有明顯差異（見(jiàn)表1）。

表1 Livin和Claudin-4在前列腺癌中的表達(dá)與前列腺患者臨床病理關(guān)系

2.3 前列腺癌中兩者表達(dá)之間的關(guān)系 對(duì)相同患者的同一病理切片同時(shí)行Livin和Claudin-4染色后進(jìn)行Spearmen相關(guān)性分析，在48例Livin陽(yáng)性病例中,Claudin-4陽(yáng)性表達(dá)39例；兩者都為陰性3例，相關(guān)性分析顯示兩者呈正相關(guān)，r=0.87，P＜0.01，見(jiàn)圖2。

圖2 Livin和Claudin-4在前列腺癌中Spearmen相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

前列腺癌發(fā)生進(jìn)展與基因調(diào)節(jié)的細(xì)胞異常增殖和凋亡功能散失有關(guān)。內(nèi)源性抗凋亡蛋白Livin基因通過(guò)抑制半胱天冬酶激活因子（Smac）導(dǎo)致Caspase-3和Caspase-7酶的水解從而抑制了細(xì)胞的凋亡[4-5]；而Claudins是構(gòu)成緊密連接的主要成分，參與維持細(xì)胞極化的細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。研究顯示，細(xì)胞間的連接結(jié)構(gòu)和功能的改變后腫瘤細(xì)胞更易于脫離原發(fā)灶，穿過(guò)細(xì)胞間隙進(jìn)入血管或淋巴管，引起腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)使用組織芯片和免疫組化SP法對(duì)Livin和Claudin-4在前列腺癌和增生前列腺組織中的表達(dá)狀況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，Livin和Claudin-4在前列腺增生組織內(nèi)極少表達(dá)．而在前列腺癌內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)，在前列腺增生組織中表達(dá)率明顯下降，在前列腺癌中39例Gleason評(píng)分＜7分的陽(yáng)性表達(dá)率為56.41%（22/39），在32例前列腺癌Gleason評(píng)分≥7分的表達(dá)率為82.05%（26/32），兩者之間比較有差異。在前列腺癌Ⅰ～Ⅱ期表達(dá)率56.10%（23/41）和Ⅲ～Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%（25/30），兩者相比有明顯差異（P＜0.05），Claudin-4在39例前列腺癌＜7分的陽(yáng)性表達(dá)率為43.59%（17/39），Claudin-4在32例前列腺癌≥7分的表達(dá)率為75.00%（24/32），兩者之間比較有差異。在Ⅰ～Ⅱ期表達(dá)率60.98%（25/41）和Ⅲ～Ⅳ期陽(yáng)性表達(dá)率為80.00%（24/30），兩者相比有明顯差異（見(jiàn)表1）。結(jié)果顯示在前列腺癌中Livin的異常表達(dá)可能在前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展中有重要作用。

Maeda等[8]體外實(shí)驗(yàn)對(duì)人類(lèi)前列腺癌的細(xì)胞株（22Rv1，DU145和PC3）和正常的人類(lèi)前列腺上皮細(xì)胞（PrECs）中Claudin-3和Claudin-4的表達(dá)水平及細(xì)胞定位進(jìn)行研究，同時(shí)應(yīng)用產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）引發(fā)上皮細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)觀察靶向干擾Claudin-3和/或Claudin-4的CPE介導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)PC3裸鼠移植瘤的治療效果，結(jié)果顯示Claudin-4和Claudin-3在人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞系22Rv1，DU145和PC3異常增高表達(dá)。靶向干擾Claudin-4后PC3和22Rv1細(xì)胞株中細(xì)胞毒性顯著下降，移植瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制。證實(shí)了Claudin-4在前列腺癌細(xì)胞中存在異常表達(dá)。我們前期也利用組織芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)前列腺癌中存在Claudin-4基因和蛋白的異常表達(dá)，進(jìn)而對(duì)其與前列腺癌分化和臨床分期進(jìn)行研究。

Livin與前列腺癌分期和分化程度相關(guān)[9-10]，國(guó)內(nèi)也有對(duì)前列腺癌組織中Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)與前列腺癌臨床分期和分化程度的報(bào)告[11-12]，Livin以何種方式進(jìn)行作用，研究顯示：Livin通過(guò)抑制凋亡激活信號(hào)通路[13-14]；Claudin-4異常表達(dá)影響細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞極性，致使腫瘤信號(hào)系統(tǒng)異常，刺激腫瘤增殖[15]，我們還對(duì)前列腺癌中Livin蛋白和Claudin-4的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，前列腺癌中Livin蛋白和和Claudin-4有正相關(guān)性，據(jù)此推測(cè)，Livin在前列腺癌異常表達(dá)可能促進(jìn)了Claudin-4異常增高表達(dá)，它們共同參與了前列腺癌發(fā)生進(jìn)展，它們?cè)谇傲邢僦挟惓１磉_(dá)呈現(xiàn)出分期越晚，表達(dá)率越高，表示它們?cè)谇傲邢侔┭葸M(jìn)中起重要作用。

總之，凋亡抑制基因Livin和Claudin-4在前列腺癌中異常表達(dá)，它們可能共同參與了前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展，但Livin和Claudin-4在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)通過(guò)何種機(jī)制對(duì)前列腺癌進(jìn)展起作用，靶向干擾Livin和Claudin-4是否可以影響前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿：2016-09-02 修回：2016-11-20）（責(zé)任編輯 張亞強(qiáng)）

Expression and Significance of Livin and Claudin-4 Protein in Prostate Cancers with Tissue Microar-ray

ZHANG Chun-ting,ZHU Zai-sheng.
Department of Urology,Zhejiang University Jinhua Hospital,Jin-hua(321000),China

Objective To explore the relationship of clinical pathological characteristics and expression of Livin and Claudin-4 protein in prostate cancers. Methods Tissue microarray technology was used for detect tissues for 71 cases with prostate cancer and 37 patients with benign prostatic hyperplasia.Total 64 paraffin microarray were arranged.ImmunohistochemicalSP method was used to detect expression of Livin and Claudin-4 protein in the chip.Relationship between expression of Livin and Claudin-4 and clinicopathologic features.Spearman rank correlation was used toassess the relationship between expression of Livin and Claudin-4. Results The positive expression rates of Livin and Claudin-4 in benign prostatic hyperplasia tissues were significantly lower than those in prostate cancer tissues(P＜0.01).The positive expression rates of Livin in prostate cancer tissues were 56.41%(22/39) (Gleason score＜7)and 81.25%(26/32)(Gleason score≥7).The positive expression rates of Livin were 56.10% (23/41)in stage I～I(xiàn)I and 83.33%(25/30)in stageⅢ～Ⅳ,respectively.The positive expression rates of Claudin-4 were in prostate cancer tissues were 43.59(17/39)for Gleason score＜7 and 75.00(24/32)for Gleason Score≥7. For stage I～I(xiàn)I andⅢ～Ⅳ,the expression of Claudin-4 were 60.98%(25/41)and 80.00%(24/30),respectively. The expression of Livin and Claudin-4 was positively correlated by Spearman's rank correlation(r=0.87). Conclusion Abnormal expression of Livin and Claudin-4 protein may be involved in generation and development of prostate cancer.Combined detection can assess the prognosis of prostate cancer.

Prostate cancer;livin;claudin-4;tissue microarray;immunohistochemistry

R737.25

A

1007-6948(2017)02-0118-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.02.004

浙江省金華市科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目資助（2013-3-043）

浙江大學(xué)金華醫(yī)院泌尿外科（金華 30021l）

朱再生，E-mail：zaishengzhu@126.com