董元煥，孫蕾娜，戰(zhàn)忠利

柯薩奇病毒腺病毒受體在肺癌中的表達和意義

董元煥1，孫蕾娜2，戰(zhàn)忠利2

目的：明確柯薩奇病毒腺病毒受體（CAR）在正常肺組織、癌旁組織及肺癌組織中的表達情況以及在體外CAR失表達對人肺鱗狀細胞癌NCI-H520細胞增殖與侵襲遷移的影響。方法：收集肺癌手術(shù)切除新鮮標本100例及其對應的癌旁組織和正常肺組織，應用免疫組織化學、Western blot和RT-PCR法檢測CAR蛋白和mRNA的表達情況；在體外運用RNAi技術(shù)建立穩(wěn)定的低表達CAR的人肺鱗狀細胞癌NCI-H520細胞系，用平板克隆形成實驗和Transwell侵襲及遷移實驗觀察RNAi抑制CAR基因表達對NCI-H520肺癌細胞增殖與侵襲遷移的影響，并通過建立動物模型動態(tài)觀察瘤體的生長。結(jié)果：免疫組織化學結(jié)果顯示，CAR陽性率為48%。Western blot法檢測CAR蛋白和RT-PCR檢測CAR mRNA在肺癌組織中明顯高于正常肺組織和癌旁組織。篩選得到三組CAR基因表達受到抑制的NCI-H520穩(wěn)定細胞系。半定量RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，三組穩(wěn)定細胞系中CAR mRNA和蛋白質(zhì)表達均有不同程度的下降，其中shRNA-2抑制作用最強。平板克隆形成實驗顯示，shRNA-2抑制CAR基因表達后，NCI-H520細胞的增殖能力有所下降（P＞0.05），Transwell侵襲及遷移實驗顯示，NCI-H520細胞侵襲遷移能力明顯下降（P＜0.05）。動物模型結(jié)果顯示，抑制CAR的表達，則動物體內(nèi)移植瘤的生長就會緩慢。結(jié)論：CAR與肺癌形成和進展有關(guān)，并能夠促進肺癌細胞的侵襲和遷移活動。裸鼠肺癌移植瘤模型構(gòu)建成功，為以后肺癌的研究奠定基礎。利用RNAi有效抑制了CAR基因的表達，并抑制NCI-H520細胞在裸鼠體內(nèi)瘤體的生長，CAR有望成為肺癌基因治療的靶點之一。

柯薩奇病毒腺病毒受體；Western blot；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應；平板克隆形成實驗；移植瘤模型

柯薩奇病毒腺病毒受體（coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR）是柯薩奇B組病毒(coxsackie B virus，CBV)和腺病毒(adenovirus，Ad)與靶細胞結(jié)合的共同受體，于1997年通過免疫親和層析的方法得到分離和識別[1]。CAR屬于細胞粘附分子中的免疫球蛋白超家族[2]，由365個氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白。目前的研究表明：CAR一方面作為黏附分子[3]，在“維系”細胞與細胞之間“緊密連接”的過程中起著極其關(guān)鍵的作用；另一方面作為病毒受體，在介導病毒侵入細胞的過程中也發(fā)揮著重要作用。近年來的多項研究發(fā)現(xiàn)，CAR與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有關(guān)，且在不同的腫瘤中具有不同的生物學行為。本實驗對100例非小細胞肺癌組織進行免疫組織化學檢測及Western blot方法與RT-PCR方法檢測，采用RNA干擾抑制人肺鱗癌細胞系NCI-H520中CAR基因表達，并建立NCI-H520裸鼠皮下移植瘤模型，觀察CAR對肺癌的發(fā)生發(fā)展及腫瘤生長的影響。

1 資料和方法

1.1 標本來源 收集天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮手術(shù)標本100例及其對應的正常及癌旁組織，均經(jīng)術(shù)后病理證實為非小細胞肺癌。男70例，女30例；年齡31～77歲，中位年齡54歲。標本收集嚴格按照無菌操作，在手術(shù)中收集的標本立即放入液氮中，迅速冰凍，放入-80℃保存。

1.2 細胞系 肺癌細胞NCI-H520、LTEP-2、A549三種細胞系由天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院生物治療與免疫實驗室惠贈。NCI-H446和H1299兩種細胞系由天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院生化實驗室惠贈。五種細胞株均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并在含5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.3 實驗方法 各亞型人非小細胞肺癌共100例，每例包括癌、癌旁及正常肺組織。分兩組：（1）進行石蠟組織切片和免疫組織化學染色，觀察CAR的表達（2）取新鮮組織進行RT-PCR、Western blotting定量檢測CARmRNA及蛋白表達。對高表達CAR人肺癌細胞系進行兩組實驗：（1）SiRNA靜默CAR表達。（2）空白對照,采用平板克隆形成法檢測細胞生長增殖能力采用Transwell侵襲實驗檢測細胞體外侵襲力。

1.4 動物實驗 建立RNAi抑制CAR基因表達的肺鱗狀細胞癌NCI-H520穩(wěn)定表達細胞系，將CAR基因沉默的NCI-H520細胞移植于裸鼠體內(nèi)構(gòu)建移植瘤模型。

1.5 統(tǒng)計學分析 實驗均重復三次，計量實驗數(shù)據(jù)以均值標準差(±s)表示，應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學方法定性檢測CAR在肺癌標本中的表達 免疫組織化學結(jié)果顯示，100例肺癌標本中，48例陽性表達CAR，陽性率48%，見圖1。

圖1 肺鱗癌和腺癌中CAR表達

2.2 Western blot檢測CAR蛋白、應用RT-PCR檢測mRNA表達 CAR蛋白在肺癌組織中的表達高于正常組織和癌旁組織，其差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.009,P=0.027，n=100），見表1。

表1 Western blot檢測CAR蛋白在正常組織、癌旁組織、癌組織中的表達

CAR mRNA在肺癌組織中表達高于癌旁或正常肺組織,其差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007,P= 0.022，n=100），見表2，圖2。

表2 RT-PCR檢測CAR mRNA表達的相對灰度值(±s)

表2 RT-PCR檢測CAR mRNA表達的相對灰度值(±s)

注：與正常肺組織比較，aP＜0.05；與癌旁組織比較，bP＜0.05

組織類別正常肺組織癌旁組織癌組織CAR mRNA(±s) 1.000±0.012 1.048±0.035 1.282±0.072a、b

圖2 Western blot檢測CAR蛋白及RT-PCR擴增結(jié)果

2.3 RT-PCR、Western blot檢測五種肺癌細胞系中CAR mRNA及CAR蛋白的表達 五種肺癌細胞系中CAR mRNA表達水平與其蛋白表達水平相一致，NCI-H520細胞系的CAR基因表達水平最高，因此我們選取NCI-H520細胞系進行后續(xù)的RNAi研究，見圖3。

2.4 建立RNAi穩(wěn)定表達細胞系 在6孔板中，應用X-treme HP轉(zhuǎn)染試劑，瞬時轉(zhuǎn)染NCI-H520細胞三組shRNA重組質(zhì)粒和空載體陰性對照質(zhì)粒，RNAi穩(wěn)定表達的多克隆肺癌細胞株篩選成功，見圖4。

圖3 PCR及Western檢測五種細胞系CAR表達

圖4 轉(zhuǎn)染NCI-H520細胞三組shRNA重組質(zhì)粒和空載體陰性對照質(zhì)粒

2.5 RNAi穩(wěn)定表達細胞系中CAR基因表達干擾的抑制效果 3組重組質(zhì)粒中shRNA2對NCI-H520 CAR mRNA表達的抑制作用最強，見圖5。

圖5RT-PCR檢測CAR mRNA表達變化

2.6 應用Western blot檢測CAR蛋白表達干擾的抑制效果 3組重組質(zhì)粒中shRNA2對NCI-H520 CAR蛋白表達的抑制作用最強，見圖6。

圖6 Western檢測CAR蛋白表達

2.7 平板克隆形成實驗檢測抑制CAR表達后對細胞增殖能力的影響 兩周后三組細胞增殖情況。顯微鏡下觀察計數(shù)三組細胞在6孔板中形成的克隆數(shù)，得到相應克隆形成率（見圖7）?？瞻讓φ战M、陰性對照組及實驗組克隆形成率分別為71.2%、59.0%和53.8%，方差分析比較三組細胞克隆形成率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果表明CAR基因表達抑制后對NCI-H520細胞系增殖能力影響不大。

圖7 抑制CAR表達后對細胞增殖能力的影響

2.8 Transwell侵襲實驗檢測抑制CAR表達后對細胞能力的影響 顯微鏡下觀察計數(shù)(見圖8)，空白對照組侵襲Matrigel穿過濾膜數(shù)為（52.20±3.65）個，陰性對照組侵襲Matrigel穿過濾膜數(shù)為（46.10±2.16）個，實驗組侵襲Matrigel穿過濾膜數(shù)為（19.60±2.58）個，空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義，實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示：針對目的基因的RNAi降低NCI-H520細胞CAR表達后，細胞的侵襲能力明顯低于空白對照組。

2.9 Transwell遷移實驗檢測抑制CAR表達后對細胞遷移能力的影響 顯微鏡下觀察計數(shù)(見圖9)，空白對照組穿過濾膜數(shù)為（71.50±1.48）個，陰性對照組穿過濾膜數(shù)為（69.40±3.65）個，實驗組穿過濾膜數(shù)為（21.80±2.75）個，空白對照組與陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義，實驗組與空白對照組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示：針對目的基因的RNAi降低NCI-H520細胞CAR表達后，細胞的遷移能力明顯低于空白對照組。

圖8 Transwell小室檢測三組細胞侵襲能力的改變

圖9 Transwell小室檢測三組細胞遷移能力的改變

2.10 腫瘤形成實驗 利用RNAi有效抑制了CAR基因的表達，并有效抑制了移植瘤的生長，見圖10。

圖10 3組人肺癌細胞株NCI-H520裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長曲線及體積變化

3 討論

肺癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居前列，且呈逐年上升趨勢，其中非小細胞肺癌的發(fā)生更是引起高度重視[4]。肺癌的發(fā)生機制是當今研究的重點方向[5]。自1997年初識CAR蛋白后，其表達量與多種疾病的關(guān)系得到廣泛的研究探討[6]。隨著對腺病毒載體基因治療的深入，CAR蛋白在肺癌中的表達及其與臨床病理因素及預后的關(guān)系得到了更為深入的研究。目前已證實，CAR表達于多種腫瘤組織中，如食管癌、結(jié)腸癌、胃癌、膠質(zhì)瘤等[7-8]。Giaginis等[9]在對子宮內(nèi)膜癌的研究中發(fā)現(xiàn)，高分化子宮內(nèi)膜癌幾乎不表達CAR，他通過分析CAR表達與細胞增殖抗原Ki67表達的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CAR的高表達與腫瘤增殖能力的增加有關(guān)。并且在大多數(shù)骨肉瘤細胞系、所有的Ewing肉瘤細胞系[10]、乳腺癌[11]中CAR表達也是增加的。兩個相反的結(jié)論提示我們，CAR在不同類型的腫瘤具有不同的生物行為。

關(guān)于CAR與肺癌關(guān)系的研究，目前報道的不多。我們應用RT-PCR、免疫組織化學和Western blot方法，檢測了大量肺癌組織樣品中CAR的表達情況，相關(guān)的在組織學水平上研究CAR表達的臨床意義尚未見報道。我們發(fā)現(xiàn)，在CAR mRNA和蛋白在正常肺組織和癌旁組織中幾乎無表達，但是在大多數(shù)的肺癌標本中CAR無論核酸和蛋白均有高水平的表達，這提示CAR的表達與肺癌可能具有相關(guān)性。為了深入了解CAR基因在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本研究在此基礎之上，采用RNA干擾方法建立CAR表達穩(wěn)定下調(diào)的肺癌細胞系，對CAR基因的功能進行了較系統(tǒng)的研究。

Verma等[12]于2003年首次將RNAi應用到裸鼠移植瘤[13-14]內(nèi)，隨后國內(nèi)外學者進行了大量的RNAi裸鼠體內(nèi)研究。本課題組采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)靜默CAR基因的表達，并且應用于裸鼠移植瘤中。在平板克隆形成實驗中發(fā)現(xiàn)，CAR基因表達抑制后對NCI-H520細胞系體外增殖能力影響不大，但是在腫瘤形成實驗中實驗組與空白對照組和陰性載體對照組相比，瘤體重量明顯減小。說明利用RNAi有效抑制了CAR基因的表達，并有效抑制了移植瘤的生長，從而為進一步探索CAR基因的生物學功能和利用RNAi技術(shù)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展提供實驗依據(jù)。Qin等[15]在研究CAR在成瘤過程中的角色時，還比較了對照組與反義CAR細胞在體外生長潛力的差別，發(fā)現(xiàn)在塑料上生長時兩者增殖能力僅有極微小的差別，但在軟瓊脂上形成集落后，這種相對性增殖能力差異表現(xiàn)出明顯的不同。這些數(shù)據(jù)與我們的實驗結(jié)果一致，預示在裸鼠體內(nèi)CAR的表達在肺癌的增殖中是必須的，并且在激發(fā)肺癌細胞某種亞型的有效形成中是必須的。RNAi技術(shù)是指由人工導入的雙鏈RNA介導的特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)。通過敲低腫瘤的凋亡抑制基因、促增生基因、腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移基因的表達，達到抑制腫瘤的效果。同時，RNAi在裸鼠移植瘤內(nèi)可作為腫瘤放化療的輔助手段。

綜上所述，本研究在之前研究基礎上，利用建立和篩選得到的穩(wěn)定抑制CAR基因表達的肺鱗狀細胞癌NCI-H520細胞系，運用平板克隆形成實驗和Transwell侵襲及遷移實驗分析了CAR降表達組、空載體組及未轉(zhuǎn)染組之間增殖、侵襲、遷移能力的差異，揭示了CAR基因?qū)CI-H520細胞增殖、侵襲和遷移的影響。研究結(jié)果顯示，CAR基因?qū)Ψ伟┘毎鲋衬芰Φ挠绊懖伙@著，但其在肺癌細胞的侵襲及遷移過程中發(fā)揮了重要作用，CAR基因的表達水平的高低可能代表了肺癌細胞侵襲遷移能力的大小。在此我們初步探討了CAR基因在體外培養(yǎng)的人肺癌細胞中的生物學功能，為進一步通過肺癌動物模型在體內(nèi)研究CAR基因的作用打下了基礎，同時也為人CAR基因的生物學功能及其在肺部腫瘤中作用機制的研究提供了參考。

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（收稿：2016-08-06 修回：2017-02-22）

（責任編輯 屈振亮 何培坤）

Coxsackie Adenovirus Receptor Expression in Lung Cancer and Its Significance

DONG Yuan-huan,SUN Lei-na,ZHAN Zhong-li
Department of Pathology,Ninghe District Hospital,Tianjin(301500),China

Objective To investigate the expression of(Coxsackie virus adenovirus receptor，CAR)in normal lung tissue,para-cancerous tissue and lung cancer tissues and the effect of CAR expression in vitro on proliferation，invasion and migration of human lung squamous cell carcinoma NCI-H520 cells. Methods Total 100 cases of lung cancer,adjacent tissues and normal lung tissues were collected.Immunohistochemistry,Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of CAR protein and mRNA.RNAi technique was used to diminish CAR expression.The effects of RNAi on the proliferation,invasion and migration of NCI-H520 lung cancer cells were studied by plate cloning assay and transwell invasion and migration experiments.The animal model was used to study the growth of the cancer cells in vivo. Results Immunohistochemical results showed that the positive rate of CAR was 48%.Western blot analysis showed expression of CAR protein and CAR mRNA were significantly higher in lung cancer than that in normal lung tissues and cancer-adjacent tissues.Three NCI-H520 sub-lines with inhibited CARgene were screened.Semi-quantitative RT-PCR and Western blot showed that the expression of CAR mRNA and protein in these cells decreased in different degrees,and shRNA-2 had the strongest inhibitory effect.Plate clone formation assay showed that shRNA-2 inhibited the proliferation of NCI-H520 cells(P＜0.05).Transwell invasion and migration experiments showed that CAR-inhibited NCI-H520 cells had a significant decrease in invasion and migration(P＜0.05).Animal model results show that following the inhibition of CAR expression,the growth of transplanted tumors in animals was inhibited slow. Conclusion CAR is associated with the development and progression of lung cancer and can promote the invasion and migration of lung cancer cells.Nude mice lung cancer transplanted tumor model was successfully established for the future study of lung cancer.The expression of CAR gene was effectively inhibited by RNAi,and,therefore,the growth of NCI-H520 cells in nude mice was inhibited.CAR was expected to be one of the targets of lung cancer gene therapy.

Coxsackie adenovirus receptor;western blot;RT-PCR;colony formation assay transwell experiments;transplanted tumor model

R734.2

A

1007-6948(2017)02-0113-06

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.02.003

天津市衛(wèi)生局局級基金項目（2010KZ11）

1.天津市寧河區(qū)醫(yī)院病理科（天津 301500）

2.天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科；國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心（天津 300600）

戰(zhàn)忠利，E-mail：dongyuanhuan1@163.com