陳偉娜　王燕清　陳嘉璐

[摘要]目的建立注射用替加環(huán)素?zé)o菌的方法適用性。方法用100mL 0.1%的MgCh溶液沖洗后，再用700mL pH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，以消除替加環(huán)素樣品的抑菌活性，進(jìn)行注射用替加環(huán)素的細(xì)菌及真菌的無菌驗(yàn)證。結(jié)果采用上述方法進(jìn)行驗(yàn)證，6種菌的供試品與陽性對(duì)照生長狀況一致。結(jié)論注射用替加環(huán)素的無菌檢驗(yàn)，需要用100mL 0.1%的MgCl2溶液沖洗后，再用700mL pH7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗。

[關(guān)鍵詞]注射用替加環(huán)素；無菌檢查；方法適用性；MgCh；吐溫-80

替加環(huán)素由惠氏（Wyeth）公司研發(fā)，美國FDA于2005年6月和2006年7月批準(zhǔn)惠氏的替加環(huán)素（Tigecycline，商品名Tygacil注射用替加環(huán)素）為治療復(fù)雜腹腔內(nèi)感染和復(fù)雜皮膚感染的一線藥物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。該品種是甘氨酰四環(huán)素類抗生素中獲得批準(zhǔn)的第一個(gè)產(chǎn)品。替加環(huán)素對(duì)G+菌、G-菌、厭氧菌有廣譜抗菌活性，包括多重耐藥性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎鏈球菌、VRE。對(duì)不同耐藥機(jī)制的耐四環(huán)素致病菌同樣有效，但對(duì)銅綠假單胞菌無抗菌活性。替加環(huán)素是新型甘胺酰環(huán)素類抗生素，主要與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合，阻礙氨基酸肽延長，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成來發(fā)揮抗菌活性。他克服或限制了很多抗菌藥物產(chǎn)生的兩種主要耐藥機(jī)制：外排泵和核糖體保護(hù)。避免了四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制對(duì)其產(chǎn)生作用。

為消除本品的抑菌活性，在無菌方法學(xué)驗(yàn)證中，本研究采用了多種樣品處理辦法，包括添加高錳酸鉀溶液、硫酸銅溶液、檸檬酸鈉溶液、氯化鎂溶液、0.1%吐溫-80等，結(jié)果表明：以高錳酸鉀溶液、硫酸銅溶液、檸檬酸鈉溶液處理樣品，均不能有效消除本品的抑菌活性；注射用替加環(huán)素進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中采用的氯化鎂溶液及0.1M的HCl溶液處理樣品能消除樣品抑菌活性，但驗(yàn)證表明，該操作中用到0.1M鹽酸，對(duì)試驗(yàn)菌有滅活作用；0.1%吐溫-80處理樣品，能有效消除本品的抑菌活性，而且對(duì)試驗(yàn)菌無滅活作用。因而最終采用薄膜過濾法，用100mL 0.1%的MgCl.溶液沖洗后，再用700mLpH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗。

1.材料

1.1實(shí)驗(yàn)器材

HTY-SPA型無菌隔離倉（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），BKF330型全封閉集菌培養(yǎng)器（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），LRH-250A型生化培養(yǎng)箱（廣東醫(yī)療器械廠）。

1.2樣品

注射用替加環(huán)素（規(guī)格為40mg/瓶），由麗珠醫(yī)藥集團(tuán)研究所提供。

1.3培養(yǎng)基及沖洗液

培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物有限公司。培養(yǎng)基適用性符合《中國藥典》2015版，四部（通則1101）規(guī)定。

沖洗液：pH7.0含0.1%吐溫80的0.1%蛋白胨水溶液。

1.4試驗(yàn)用菌種

金黃色葡萄球菌（staphvlococcus aureus）[CMCC（B）26003]；枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]；生孢梭菌（clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]；白念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉菌（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。菌種均來自中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

2.方法與結(jié)果

參照2015版《中國藥典》方法及注射用替加環(huán)素進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.1菌液制備

參照《中國藥典》2015版四部通則1101無菌檢查法操作，取30～35℃培養(yǎng)24h的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨培養(yǎng)物和生孢梭菌的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋得到10～100CFU/mL的菌懸液，備用。取20～25℃培養(yǎng)48h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋得到10～100CFU/mL的菌懸液，備用。取20～25℃培養(yǎng)6d黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，加入0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液4mL洗下孢子，吸出轉(zhuǎn)移至空試管作為原液，用含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，得到10～100CFU/mL的孢子懸液，備用。

2.2試驗(yàn)步驟

因?yàn)樘婕迎h(huán)素對(duì)真菌沒有抑菌活性，所以在方法學(xué)摸索的過程中只選取細(xì)菌及厭氧菌進(jìn)行驗(yàn)證，而且，為了降低工作量，細(xì)菌先用枯草芽孢桿菌做代表，待方法確定后，再進(jìn)行6種菌的驗(yàn)證，具體步驟如下。

2.2.10.1%MgCI2溶液消除抑菌能力的考察參考注射用替加環(huán)素進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)為了保證濾膜的沖洗體積不超過800mL，將0.1%MgCL2溶液的體積由750mL改為100mL，0.1M的HCL溶液的體積由750mL改為400mL，具體方法如下：取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉(zhuǎn)移至全封閉集菌培養(yǎng)器中，每菌用0.1%MgCL，溶液lOOmL沖洗后，用0.1M的HCL溶液400mL沖洗，最后用300mL的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，沖洗后在濾膜上加lmL 10～100CFU/mL的菌懸液，過濾后取出濾膜，于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中30～35℃培養(yǎng)。同時(shí)，分別用0.1%高錳酸鉀溶液、0.1%硫酸銅溶液、0.1%檸檬酸鈉溶液代替0.1%MgCL2溶液，方法同上，考察其他中和劑抑菌作用，見表1。

結(jié)果可見，唯有0.1%MgCl溶液能夠消除注射用替加環(huán)素的抑菌作用。

為了考察處理用溶液對(duì)菌液的影響，我們用10～I(xiàn)OOCFU的菌液代替供試品溶液，方法同上，由表2結(jié)果可知，0.1M的HCl溶液對(duì)細(xì)菌的生長有抑制作用。

2.2.2沖洗液的確定 參考我們?cè)谧鲈摦a(chǎn)品原料微生物限度驗(yàn)證時(shí)的經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合以上試驗(yàn)結(jié)果，擬對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整：取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉(zhuǎn)移至全封閉集菌培養(yǎng)器中，每菌分別用700mLpH 7.0含0.1%及0.3%的吐溫80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗后，在濾膜上加1mL 10～100CFU/mL的菌懸液，過濾后取出濾膜，于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中30～35℃培養(yǎng)。同時(shí)為了考察處理用溶液對(duì)菌液的抑菌作用，用10～100CFU的菌液代替供試品，同法操作（注：最后過濾后不再加菌液），由表3可知，用700mL的0.1%及0.3%的吐溫80的0.1%無菌蛋白胨溶液替代400mL 0.1MHCL溶液和300mL 0.1%無菌蛋白胨溶液組合作為沖洗液，能夠符合無菌驗(yàn)證的要求，而且，為了試驗(yàn)方便，最終選擇0.1%的吐溫80的0.1%無菌蛋白胨溶液。

2.2.3方法適用性實(shí)驗(yàn)的確定 用以上確定的方法，進(jìn)行細(xì)菌、真菌的驗(yàn)證。細(xì)菌驗(yàn)證采用薄膜過濾法，取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉(zhuǎn)移至全封閉集菌培養(yǎng)器中，每菌用100mL 0.1%的MgCL2溶液沖洗后，再用700mL pH7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，沖洗后注入100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，并加入1mL試驗(yàn)菌菌液，搖勻；另取一裝有同樣體積培養(yǎng)基的濾筒，加入等量的試驗(yàn)菌，搖勻，作為對(duì)照菌液。置30～35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，結(jié)果見表4。霉菌、酵母菌驗(yàn)證采用薄膜過濾法，按上述同法操作，沖洗后注入100mL沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，并加入1mL試驗(yàn)菌菌液，搖勻；另取一裝有同樣體積培養(yǎng)基的濾筒，加入等量的試驗(yàn)菌，搖勻作為對(duì)照菌液。置23-28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。見表4。

2.3試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證結(jié)果表明：與陽性對(duì)照比較，含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好。以該法操作，能夠消除替加環(huán)素樣品的抑菌活性，方法可行。

即采用薄膜過濾法，取供試品10瓶/菌，以約50mL無菌氯化鈉溶液溶解并轉(zhuǎn)移至全封閉集菌培養(yǎng)器中，每菌用lOOmL 0.1%的MgCl.溶液沖洗后，再用700mL pH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，沖洗后注入100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖培養(yǎng)基，并加入lmL試驗(yàn)菌菌液，分別培養(yǎng)。

3.討論

因替加環(huán)素對(duì)G+菌、G-菌、厭氧菌有廣譜抗菌活性，包括多重耐藥性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎鏈球菌、VRE，所以不能使用常規(guī)方法進(jìn)行無菌的方法適用性實(shí)驗(yàn)。注射用替加環(huán)素的進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20100227已有無菌驗(yàn)證方法，但其存在一定的問題：（1）沖洗液體積過多，其采用750mL 0.1%的MgCL.溶液沖洗后再用750mL的0.1M的HCL溶液，最后再用300mL的0.1%無菌蛋白胨溶液沖洗，總沖洗體積達(dá)到1800mL；（2）0.1M的HCL溶液對(duì)試驗(yàn)菌有抑菌活性，陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，菌液不生長。

在藥品無菌、微生物限度檢查等實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于抑菌性供試品可以使用適宜的中和劑消除抑菌成分，使用的中和劑不應(yīng)與培養(yǎng)基發(fā)生反應(yīng)，不應(yīng)改變培養(yǎng)基原有性狀，不應(yīng)對(duì)結(jié)果判斷產(chǎn)生影響。MgCl.溶液作為無菌驗(yàn)證中的中和劑，在有抑菌作用的藥物應(yīng)用廣泛。在稀釋液、沖洗液添加Mg2+作為中和劑，與培養(yǎng)基中的添加應(yīng)用不同。稀釋液、沖洗液為一過性使用，即樣品制備、作用一定時(shí)間后，可以采用適宜的方法去除，從而消除其可能對(duì)實(shí)驗(yàn)帶來的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mg2+作為小分子的無機(jī)化合物，極易通過濾膜，稍加沖洗，即可去除。

當(dāng)藥品本身具有抗菌活性時(shí)，應(yīng)當(dāng)首先消除其抗菌活性，才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和有效性。對(duì)于一些抑菌活性較強(qiáng)的抗生素，要消除其抑菌活性，可在沖洗液中加入一定濃度的吐溫80。本研究參考了原料微生物限度驗(yàn)證時(shí)的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)吐溫80的濃度進(jìn)行了摸索，確定了該產(chǎn)品驗(yàn)證時(shí)的吐溫濃度為0.1%。

本方法結(jié)合了進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中的MgCl2溶液的中和作用，同時(shí)增加了pH 7.0含0.1%吐溫-80的0.1%無菌蛋白胨溶液作為沖洗液，該方法驗(yàn)證6種菌均符合規(guī)定，方法可行。