周中凱，劉志倫，張惠媛

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

富GABA米糠改善大鼠氧化應(yīng)激和肝功能損傷

周中凱，劉志倫，張惠媛

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

研究富伽馬氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）米糠有效改善高脂飲食誘發(fā)大鼠氧化應(yīng)激和肝功能損傷。添加GABA前體物L(fēng)-谷氨酸，通過原米糠中脫酸酶轉(zhuǎn)化獲得富GABA米糠，其中GABA的含量由32mg/100 g升高至242mg/100 g。原米糠、富GABA米糠分別添加到高脂飼料，試驗(yàn)大鼠分為正常對(duì)照組、高脂飼料組、普通米糠組和富GABA米糠組，考察普通米糠、富GABA米糠對(duì)高脂飲食大鼠的體重、肝指數(shù)、肝功能及氧化應(yīng)激的影響。富GABA米糠組大鼠體重明顯低于高脂飼料組大鼠和普通米糠組大鼠（p＜0.5），富GABA米糠在減輕肝臟細(xì)胞脂肪變性、降低轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶、改善肝臟氧化應(yīng)激等方面優(yōu)于普通米糠組大鼠。

普通米糠；富GABA米糠；高脂飲食；肝功能；氧化應(yīng)激

隨著人們的生活水平的不斷提高，與之伴隨的高脂飲食成為了普遍現(xiàn)象，由此引發(fā)的肥胖、高血壓、代謝綜合癥、非酒精脂肪肝等疾病也越來越多，威脅人們的身體健康[1-3]。特別是肥胖，不僅增加心血管疾病、糖尿病、慢性腎臟疾病等疾病患病率[4-6]，而且易引起脂肪肝，引發(fā)肝臟脂肪代謝紊亂及造成肝功能受損[7]，降低體重是保持肝臟健康的重要策略之一，而傳統(tǒng)藥物都過于昂貴或副作用大，因此通過食物干預(yù)有效控制體重與改善肝臟功能成為研究熱點(diǎn)之一。

米糠做為稻米生產(chǎn)的副產(chǎn)物，含有低致敏性蛋白、纖維素、谷維素、神經(jīng)酰胺、二十八烷醇、生育三烯酚等多種天然活性成分及抗氧化物質(zhì)[8-9]。伽馬氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種從細(xì)菌到植物和脊椎動(dòng)物普遍存在的非蛋白質(zhì)氨基酸[10]。它可以由L-谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化而來，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[11]。同時(shí)也具有降低血脂的功能，及改善氧化應(yīng)激、改善肝腎功能的作用[12]，而在普通米糠中GABA含量較低，其功能性表達(dá)較弱，為此本試驗(yàn)嘗試添加GABA的前體物質(zhì)（L-谷氨酸），通過新鮮米糠谷氨酸脫羧酶的轉(zhuǎn)化作用，提升GABA的含量，使米糠中GABA的含量由32mg/100 g升高至242mg/ 100 g。同時(shí)分析在提升米糠GABA含量過程中其他活性化合物，如酚酸化合物等的含量變化情況，以及米糠抗氧化活性的變化。在獲得富GABA米糠之后，本文將同高脂飲食的動(dòng)物模型研究原米糠和富GABA米糠在調(diào)控及改善由于高脂飲食對(duì)大鼠代謝失衡所引發(fā)的副作用，對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)和利用米糠資源提供一條新思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和飼料

新鮮米糠：國(guó)家粳稻工程技術(shù)中心提供。

SPF級(jí)雄性健康Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入，體重140 g～150 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。大鼠基礎(chǔ)飼料配方：粗蛋白≥18.0%，粗纖維≤5.0%，粗脂肪≥4.0%，灰分≤8.0%，水分≤10.0%，鈣1.0%～1.8%。高脂飼料配方：63.8%基礎(chǔ)飼料、10%蔗糖、10%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、15%豬油、1%膽固醇。

1.2 材料與試劑

總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-PX）、堿性磷酸酶（AKP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的檢測(cè)試劑盒：均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3 米糠的培養(yǎng)與干燥

富GABA米糠[13]：新鮮米糠用5mmol/L的谷氨酸水溶液把水分調(diào)至30%，裝袋后充入氮?dú)饷芊猓湃牒銣嘏囵B(yǎng)箱中，40℃下培養(yǎng)5 h。培養(yǎng)后真空進(jìn)行干燥（50℃，12 h）。干燥后打碎，冷藏備用。

1.4 動(dòng)物分組及處理方法

基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)一周，40只SD大鼠分為4組，分別為正常對(duì)照組（普通飼料），高脂飼料組（高脂飼料），普通米糠組（85%高脂飼料+15%普通米糠）、富GABA米糠組（85%高脂飼料+15%富GABA米糠）。4組大鼠均自由進(jìn)水進(jìn)食，溫度20℃～25℃，濕度50%～55%。每周測(cè)量體重。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血清標(biāo)本采集

干預(yù)8周后，禁食12 h，腹主動(dòng)脈取血，血樣室溫靜置2 h后，4 000 r/min離心10min，取血清于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 肝重及肝指數(shù)測(cè)定

解剖取出大鼠肝臟后，用濾紙吸干表面水分稱重，肝指數(shù)：肝指數(shù)/%=肝重量（g）/體重（g）×100。

1.5.3 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

切取部分肝組織以10%的中性福爾馬林溶液固定，石蠟切片，HE染色，Leica光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肝臟觀察肝組織狀態(tài)。

1.5.4 肝功能指標(biāo)測(cè)定

按照測(cè)試盒的說明書測(cè)定血清中AKP、ALT、AST含量。

1.5.5 氧化應(yīng)激水平

按照測(cè)試盒的說明書測(cè)定血清中T-SOD、GSHPX、MDA及T-AOC水平。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理數(shù)據(jù)，結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±sD）表示，采用單向方差分析，以p＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通米糠、富GABA米糠對(duì)高脂飲食大鼠體重的影響

喂食8周后，4組大鼠的最終體重見圖1。

圖1 4組大鼠體重Fig.1 Weightof 4 groupsof rats

由圖1可以看出，高脂飼料組大鼠體重增加明顯（p＜0.05），體重遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組大鼠體重（p＜0.05）。分別使用普通米糠、富GABA米糠對(duì)高脂飼料大鼠進(jìn)行干預(yù)，普通米糠組大鼠和高脂飲食組大鼠體重并無差異，但富GABA米糠組大鼠對(duì)比高脂飼料組大鼠，體重降低顯著（p＜0.05），已接近正常對(duì)照組大鼠，說明富GABA米糠具有控制大鼠體重效果。

2.1 普通米糠、富GABA米糠對(duì)高脂飲食大鼠肝重、肝指數(shù)的影響

肝指數(shù)是衡量動(dòng)物肝臟健康的一項(xiàng)重要指標(biāo)，大鼠肝重及肝指數(shù)見表1。

表1 各組大鼠肝重及肝指數(shù)Table1 Liverweightand liver index of 4 groupsof rats

由表1可以看出高脂飲食的長(zhǎng)期攝入，高脂飼料組大鼠肝指數(shù)升高明顯（p＜0.05）。普通米糠組大鼠肝重及肝指數(shù)小幅下降，富GABA米糠組大鼠的肝重和肝指數(shù)顯著降低（p＜0.05），趨近正常對(duì)照組，說明富GABA米糠在維持肝重正常，降低脂肪肝方面有積極作用。

2.2 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)觀察

使用徠卡光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠肝臟組織切片見圖2。

圖2 4組大鼠肝臟切片觀察Fig.2 Liver slicesobservation of 4 groupsof rat

如圖2所示，正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞大小一致，分布密布有序，血管周圍呈放射狀，肝索整齊有序，細(xì)胞內(nèi)未見脂肪滴。高脂飼料組大鼠肝細(xì)胞排列不規(guī)則，大小不一的脂肪泡充斥在細(xì)胞內(nèi)，部分細(xì)胞被脂肪溶解，血管周圍分布雜亂無序。普通米糠組老鼠干燥切片脂肪泡數(shù)量減少，面積減小，被溶解的細(xì)胞數(shù)量減少。富GABA米糠組大鼠肝臟細(xì)胞受損程度進(jìn)一步減輕，細(xì)胞核較為清晰，細(xì)胞排列向有序化發(fā)展，血管周圍呈放射狀，整體水平趨向于正常老鼠肝臟。

2.3 普通米糠、富GABA米糠對(duì)肝功能指標(biāo)的影響

動(dòng)物體血清的轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶可以檢測(cè)肝臟受損程度，肝功能指標(biāo)見表2。

表2顯示，與正常對(duì)照組相比，高脂飼料組、普通米糠組、富GABA米糠組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）含量均有所增加，特別是ALT和AKP增加顯著（p＜0.05）。ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，只要有1%的肝細(xì)胞被破壞時(shí)，就會(huì)使血清內(nèi)ALT增高一倍，ALT為檢測(cè)肝功能損害敏感的指標(biāo)。因此3組大鼠的肝臟都有損傷，普通米糠和富GABA米糠干預(yù)后，ALT、AST和AKP均有不同程度的降低，其中富GABA米糠組的ALT水平已經(jīng)趨近正常水平（p＞0.05），在改善肝功能指標(biāo)方面優(yōu)于普通米糠。

表2 肝功能指標(biāo)統(tǒng)計(jì)表Table2 The liver function index

2.4 普通米糠、富GABA米糠對(duì)肝臟氧化應(yīng)激的影響

4組大鼠的氧化應(yīng)激指標(biāo)見表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激水平統(tǒng)計(jì)表Table3 Theoxidativestress levelof groups’rats

喂食大鼠8周后，高脂飼料組大鼠血清中總抗氧化能力（T-AOC）降低，普通米糠組大鼠小幅上升，富GABA米糠干預(yù)后，總抗氧化能力提升明顯（p＜0.05），與正常對(duì)照組無差異。由于受高脂飲食的刺激，除正常組外，總超氧化物歧化酶（T-SOD）含量都有升高，經(jīng)過干預(yù)后，富GABA米糠組大鼠T-SOD明顯高于高脂飼料組大鼠（p＜0.05）。在GSH-Px水平恢復(fù)方面，3組老鼠未表現(xiàn)出差異性。丙二醛（MDA）含量方面，高脂飼料組升高顯著（p＜0.05），兩組米糠組大鼠的MDA都有降低，但富GABA米糠組趨近于正常組水平（p＜0.05）。

3 結(jié)論

越來越多的研究表明高脂飲食引起的肥胖呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)，高脂飲食的長(zhǎng)期攝入易引起肥胖[14]。從而引起脂肪肝損傷肝臟，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，本研究中表明攝入高脂飼料的大鼠體重顯著高于正常對(duì)照組，肝指數(shù)提升明顯，血清轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶顯著升高，證實(shí)了大鼠肝臟脂肪變性，通過大鼠肝臟切片形態(tài)學(xué)觀察，進(jìn)一步證實(shí)肝功能發(fā)生損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道的高脂飲食導(dǎo)致脂肪肝及肝功能損傷一致[15]。

高脂飼料中添加定量普通米糠和富GABA米糠對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，與高脂飲食大鼠對(duì)比，均能降低大鼠體重和肝指數(shù)，其中富GABA米糠干預(yù)效果顯著。通過觀察4組肝臟組織形態(tài)，證實(shí)兩組米糠組大鼠脂肪泡減少、變小，細(xì)胞變性減輕，其中富GABA米糠組趨近于正常組水平。兩組米糠組大鼠的轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶降低，減輕了高脂飲食對(duì)肝臟的損傷。綜合各項(xiàng)指標(biāo)來看，富GABA米糠的效果好于普通米糠的效果。其中富GABA米糠中富集的GABA起到關(guān)鍵作用，謝振興等[16]也證實(shí)GABA在減輕高脂飲食對(duì)肝臟的損害，改善肝臟組織中脂肪沉積和恢復(fù)轉(zhuǎn)氨酶水平方面具有顯著效果。

長(zhǎng)期高脂飲食引起的脂肪肝影響氧化應(yīng)激水平，同時(shí)氧化應(yīng)激是脂肪肝惡化的重要原因之一[17]，表現(xiàn)在抗氧化能力減弱，抗氧化酶減少，直接導(dǎo)致機(jī)體清除自由基能力減弱。過剩的自由基破壞細(xì)胞及生命大分子（DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類），對(duì)組織造成損傷，引發(fā)代謝紊亂，影響肝臟的功能[18]。高脂飲食影響大鼠T-AOC和SOD水平，T-AOC表現(xiàn)在機(jī)體總抗氧化能力的強(qiáng)弱[19]，SOD可以有效消除氧自由基，催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)，降低超氧陰離子對(duì)機(jī)體組織造成的損傷，MDA可直接反映自由基產(chǎn)生的量及機(jī)體被氧化程度。普通米糠和富GABA米糠干預(yù)后，兩組大鼠T-AOC和SOD水平提升，MDA的含量降低，且富GABA米糠組的T-AOC，SOD水平增加明顯（p＜0.05）。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)表明富GABA米糠表現(xiàn)出了較強(qiáng)抗氧化能力，米糠中含有的酚類和酮類等小分子活性物質(zhì)可增加抗氧化能力，培養(yǎng)過的米糠中酚酸種類與含量都有升高，是抗氧化能力強(qiáng)于普通米糠的原因之一。綜合表明富GABA米糠能有效抑制大鼠過氧化水平，改善氧化應(yīng)激，且效果優(yōu)于普通米糠。

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The Improvement in Oxidative Stress and Liver Function Damage in Rats by GABA-enriched Rice Bran

ZHOU Zhong-kai，LIU Zhi-lun，ZHANGHui-yuan
（Collegeof Food Engineeringand Biotechnology，Tianjin University of Scienceand Technology，Tianjin 300457，China）

High-fat diet induced oxidative stress and liver function injury in rats were effectively improved through investigatingGABA-enrich ricebran.Thenatural ricebranwas transformed into theGABA-enrich rice bran by virtue ofaminobutyric acid enzyme，which was acquired by adding GABA precursor substance L-Glutamic acid into it.Itwas clearly found that the contentof GABA increased from 32mg/100 g to 242mg/100 g. Firstly，the natural rice bran and GABA-enrich rice bran were added into the high fat feedstuff respectively. Then，the effectsofGABA-enrich rice bran on high-fatdiet ratsweight，liver function and even oxidative stress were studied，the experimental rats were divided into four categories-normal control group，high-fat feed group，natural rice bran，and GABA-enrich rice bran group.Finally，itwas revealed that the ratweight in GABA-enrich rice bran group was lower than high fat fee group rats and natural rice bran group rats（P＜0.5）. Therefore，itwas proved that the GABA-enrich rice was superior to the natural rice bran in reducing liver steatosiscells，aminotransferase，alkaline phosphataseand in improving liveroxidativestress.

naturalricebran；GABA-enrich ricebran；high fatdiet；liver function；oxidativestress

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.035

2016-06-21

科技部農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化（2014GB2A100527）；國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2015GA610003）

周中凱（1964—），男（漢），教授，博士，研究方向：谷物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)。