陳義坤，羅誠浩，魏敏，李冉，岳海波，郭國寧

（湖北中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，湖北武漢430040）

微生物轉(zhuǎn)化對山楂提取物揮發(fā)性香氣成分的影響

陳義坤，羅誠浩，魏敏*，李冉，岳海波，郭國寧

（湖北中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，湖北武漢430040）

為了研究食甲醇芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）J4-1生物轉(zhuǎn)化對山楂提取物揮發(fā)性成分的影響，采用同時蒸餾萃取、GC/MS對比分析經(jīng)回流提取后由J4-1轉(zhuǎn)化的山楂提取物和對照的揮發(fā)性成分。結(jié)果表明：①微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物鑒定出58種揮發(fā)性成分，新增35種，包括己酸、乙酸己酯、丁酸己酯、松油醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、光黃素等，占總相對百分含量21%以上；對照樣品鑒定出34種揮發(fā)性成分；②相對百分含量顯著增加的有己醛、糠醛、葵醛、棕櫚酸乙酯、檸檬酸三丁酯等15種，刺激性成分如鄰苯二甲酸異丁酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯顯著降低，14種揮發(fā)性成分消失。經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化的山楂提取物揮發(fā)性成分改變大，具有酸甜、奶香豐富香氣，刺激性成分減少，香氣質(zhì)提高。

食甲醇芽孢桿菌（J4-1）；微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物；GC/MS；揮發(fā)性香氣成分

山楂（Crataegus pinnatifida Bunge），又名山里紅、山里果，核果類水果，核質(zhì)硬，果肉薄，味微酸澀。山楂具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，富含VC、多糖、有機酸、黃酮等多種營養(yǎng)物質(zhì)及礦質(zhì)元素，具有降血脂、保肝、降壓、助消化、抗菌等功效[1]，對高血壓、糖尿病、冠心病、心絞痛等均具有輔助治療作用[2]，除藥用外，2012年國家食品藥品管理局已經(jīng)將其納入保健食品原料在征詢意見，表明應(yīng)用范圍的擴展[3]。目前，有關(guān)山楂的研究報道主要集中在它的化學成分[4-6]、黃酮類生物活性方面[7-8]、對山楂揮發(fā)性成分的提取與鑒定[9-13]，而生物技術(shù)制備天然山楂香料的化學成分分析[14]相關(guān)報道較少。本實驗研究微生物轉(zhuǎn)化對山楂揮發(fā)性成分的影響，還鮮見報道，旨在為山楂進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

食甲醇芽孢桿菌Bacillusmethylotrophicus（J4-1）：從武漢健民制藥廠土壤中篩選得到，于2012年1月11日保藏于武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心；斜面培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，BR）（馬鈴薯浸液200mL/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂13 g/L）、原始種子培養(yǎng)基（麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基）（麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5 g/L）：北京三藥科技開發(fā)公司；葡萄糖、瓊脂、麥芽糖、蛋白胨、氯化鈉、二氯甲烷、無水硫酸鈉、95%乙醇：國藥集團化學試劑有限公司，AR；馬鈴薯：市售；發(fā)酵底物為山楂提取物：市售鮮山楂（產(chǎn)地河北）。

SHP-080生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；YX.350Z滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；HQL 300B恒溫搖床：武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責任公司；Agilent6890N/5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物轉(zhuǎn)化制備山楂提取物

用接種環(huán)挑取一環(huán)J4-1到裝有200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃，150 r/min培養(yǎng)36 h。將破碎山楂果實和水按質(zhì)量比1∶30混合，回流提取3 h后，抽濾，取濾液，115℃滅菌25min；將產(chǎn)香菌J4-1接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中32℃、pH值自然，靜置培養(yǎng)72 h后置于4℃冰箱中；用上述斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在32℃，轉(zhuǎn)速120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后制得種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液按體積比10%接種到山楂濾液中，裝罐量為15%，在pH自然，溫度32℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，不避光條件下，發(fā)酵36 h，得到山楂發(fā)酵液，抽濾濃縮得到相對密度約為1.3的浸膏，與95%乙醇按質(zhì)量比1∶3進行醇沉，過夜后抽濾，除去雜質(zhì)保留濾液，并減壓濃縮除去溶劑，制得紅褐色浸膏，密度約為1.12左右，為微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物。

1.2.2 揮發(fā)性香氣成分GC/MS分析

1.2.2.1 同時蒸餾萃取

將5 g微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物裝入圓底燒瓶中，加入400mL水，用電熱套加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計時萃取2 h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并濃縮至1mL，濃縮液用于進行GC/MS分析。同樣的方法進行5 g未生物轉(zhuǎn)化山楂提取物，同時蒸餾萃取后作為對照樣，進行GC/MS分析。

1.2.2.2 GC/MS分析

HP-5MS（50m×0.25mm×0.25μm）毛細管柱；進樣溫度：250℃；分流比20∶1；載氣：He，1mL/min；升溫程序：從50℃（1min）以5℃/min升到250℃（5min）；傳輸線溫度：250℃；離子源：EI源；電子能量：70 eV；掃描范圍：50 amu～400 amu；使用WILEY和MINILAB譜庫進行檢索。

2 結(jié)果與分析

微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物及其對照的揮發(fā)性香氣成分GC/MS分析結(jié)果見表1。

表1表明：①山楂提取物對照共分離鑒定出34種揮發(fā)性香氣成分，主要包括醇類、酮類、酯類、酸類、吡喃等其他雜環(huán)化合物；②產(chǎn)香菌生物轉(zhuǎn)化山楂提取物共分離鑒定出58種香氣成分，新出現(xiàn)了35種香氣成分，新增35種，包括己酸、乙酸己酯、丁酸己酯、松油醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯、光黃素等，占總相對百分含量21%以上，其中己酸為低級脂肪酸、揮發(fā)性有機酸，揮發(fā)到空氣中給予醇和氣息；乙酸己酯具有果香氣；丁酸己酯呈青香、果香、酯香、蔬菜香及強烈的混合水果香氣和菠蘿香昧；松油醇似松針香氣，揮發(fā)到空氣中能增加青香；二氫獼猴桃內(nèi)酯，帶有香豆素樣香氣，并有麝香樣氣息；對照樣品鑒定出34種揮發(fā)性成分；②相對百分含量顯著增加的有己醛、糠醛、葵醛、棕櫚酸乙酯、檸檬酸三丁酯等15種，其中己醛呈生的油脂和青草氣及蘋果香味；糠醛具有杏仁香帶焦香；棕櫚酸乙酯是高級飽和脂肪酸，呈微弱蠟香和奶油香氣，揮發(fā)到空氣中具有柔和香氣的作用。而刺激性成分如鄰苯二甲酸異丁酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯顯著降低，14種揮發(fā)性成分消失，其中的有害刺激性成分，在熱裂解過程中容易形成強烈刺激性和雜氣物質(zhì)，增加對喉部的刺激性和粗糙感，它們的含量經(jīng)發(fā)酵后顯著降低或消失，可能是因為經(jīng)過微生物酶體系作用而分解、降解、轉(zhuǎn)化，有利于山楂香氣品質(zhì)的提高。有上述可知，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化的山楂提取物揮發(fā)性成分改變很大，具有酸甜、奶香等豐富香氣，刺激性成分減少，香氣質(zhì)提高。

表1 微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物與其對照的揮發(fā)性香氣成分GC/MS差異分析Table1 GC/MSdifferenceanalysisof volatilearoma componentsof biotransformated haWthorn extractand its control

續(xù)表1 微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物與其對照的揮發(fā)性香氣成分GC/MS差異分析Continue table1 GC/MSdifferenceanalysisof volatilearom a componentsof biotransformated haWthorn extractand its control

續(xù)表1 微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物與其對照的揮發(fā)性香氣成分GC/MS差異分析Continue table1 GC/MSdifferenceanalysisof volatilearom a com ponentsof biotransformated haWthorn extractand its control

3 結(jié)論

食甲醇芽孢桿菌（Bacillusmethylotrophicus）J4-1生物轉(zhuǎn)化山楂提取物后，對其揮發(fā)性成分影響較大，新增和消失成分種類較多，相對百分含量變化也大，賦予了微生物轉(zhuǎn)化山楂提取物酸甜、奶香等豐富香氣，減少刺激性成分，提高了香氣質(zhì)，旨為山楂進一步開發(fā)利用提供參考。

[1]吳士杰,李秋津,肖學鳳,等.山楂化學成分及藥理作用的研究[J].藥物評價研究,2010,33(4)：316－319

[2]趙萍,趙英.山楂果實加工中的塊形保持及護色技術(shù)[J].食品科學,2002,23(8)：131－133

[3]龐文悅,王蓮,張榮泉.山楂葉總黃酮生物活性研究近況進展[J].食品研究與開發(fā),2014,35(13)：134-136

[4]寇云云.山楂中三萜類化合物提取與成分分析[D].秦皇島：河北科技師范學院,2012

[5]楊濱,李化,趙宇新,等.山楂炮制前后有機酸含量變化[J].中國中藥雜志,2004,29(11)：1057－1060

[6]孟慶杰,王光全,張麗.山楂功能因子及保健食品的開發(fā)利用[J].食品科學,2006,27(12)：873－877

[7]張遠榮,蔣企洲.山楂葉黃酮的抗氧化作用[J].藥學與臨床研究, 2011,19(3)：287-288

[8]劉俊芳,連建學,李昌俊,等.山楂葉總黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用研究[J].中國藥房,2011,22(35)：3277-3280

[9]高婷婷,韓帥,劉玉平,等.固相微萃取結(jié)合GC-MS分析鮮山楂果肉中的揮發(fā)性成分[J].食品科學,2013,34(20)：144-146

[10]高婷婷,孫潔雯,楊克玉.SDE-GC-MS分析鮮山楂果肉中的揮發(fā)性成分[J].食品科學技術(shù)學報,2015,33(3)：22-27

[11]冷檢,秦文斌,秦正龍.山楂揮發(fā)性組分色譜保留時間的定量構(gòu)效關(guān)系研究[J].食品研究與開發(fā),2015,36(15)：105-108

[12]孫琳娟,李曉穎,陳敏,等.山楂漿與不同加工方式山楂粉中揮發(fā)性成分分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(2)：164-171

[13]繆恩銘,耿永勤,楊葉昆,等.幾種煙用香精香料熱裂解產(chǎn)物、揮發(fā)性成分的分析比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(14)：8205－8209

[14]張峻松,張文葉,劉程毅,等.生物技術(shù)制備的天然山楂香料的化學成分分析[J].精細化工,2006,23(10)：977-979,1013

Influence of Biotransformation on the Volatile Arom a Com ponents of HaWthorn Extract

CHENYi-kun，LUOCheng-hao，WEIMin*，LIRan，YUEHai-bo，GUOGuo-ning
（Technology CenterofChina Tobacco Hubei Industry Limited-liability Company，Wuhan 430040，Hubei，China）

To Study the influence ofbiotransformation on the volatile components of hawthorn extract，the constituents in the biotransformed hawthorn extract and its contrastwere analyzed by GC/MS after simultaneous distillation.Results：①58 volatile componentswere identified from the biotransformed hawthorn extract，including 35 kinds of new：hexanoic acid，acetic acid ester，hexyl butyrate，terpinol，dihydroactinidiolide，lumiflavine，etc.，which accounted for21%of the total volatile componentsof thebiotransformed hawthorn extract；and 34 kinds of volatile componentswere identified from the control samples；②15 kinds of volatile components'relative percentage content increased significantly，including hexanal，furfural，decanal，hexadecanoic acid，ethyl palmitate，tributyl citrate，etc.；Irritating ingredients such as 1，2-Benzenedicarboxylic acid，butyl 2-methylpropylester and 1，2-Benzenedicarboxylic acid，mono（2-ethylhexyl）ester decreased significantly；14 kindsofvolatile componentsdisappeared.Afterbiotrasformation，the volatile componentsofhawthorn extract has changed greatly，with sweet and sour，milk fragrance rich aroma，and stimulating ingredients reduce、improving the quality ofaroma.

Bacillusmethylotrophicus（J4-1）；biotransformed hawthorn extract；GC/MS；volatile aroma components

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.033

2016-07-18

陳義坤（1975—），男（漢），工程師，博士，研究方向：天然香料開發(fā)。

*通信作者：魏敏（1979—），女（漢），高級工程師，碩士，研究方向：生物技術(shù)開發(fā)天然食品添加劑。