吳悠，周涵黎，梅霜，馬明蘭，譚珺雋，張琳，劉陽，*

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430223；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430073）

二硫腙比色法測定核桃多肽口服乳劑中鋅含量

吳悠1，2，周涵黎1，2，梅霜1，馬明蘭1，譚珺雋1，張琳1，劉陽1，2，*

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430223；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430073）

建立測定核桃多肽口服乳劑中鋅的二硫腙比色法。利用正交試驗確定預(yù)處理方法，采用二硫腙一次提取和二次提取法測定乳劑中的鋅，并對兩種方法的準(zhǔn)確度、精密度和線性進(jìn)行了驗證和比較。乳劑試樣預(yù)處理最佳條件為：硝酸：硫酸體積比為3∶1進(jìn)行炭化，600℃、8h完全灰化。與一次提取法相比，二硫腙二次提取法測定鋅在0～5.0μg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度相關(guān)系數(shù)為0.999 8（n=6），加標(biāo)回收率97.21%～102.21%，RSD=2.4%。該法準(zhǔn)確度高，精密度好，可用于測定核桃多肽口服乳劑中的鋅含量。

核桃多肽；乳劑；鋅；二硫腙比色法

我國是以谷類為主食的國家，人群缺鋅比較普遍，而在所有堅果中核桃抗氧化物質(zhì)含量較高，已被證明能夠降低Ⅱ型糖尿病發(fā)病的風(fēng)險[1]。核桃多肽口服乳劑由生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心實驗室采用干膠法[2]制備，主要由大豆油、復(fù)合乳化劑（吐溫80、阿拉伯膠、西黃芪膠）以及核桃多肽、鋅組成。多肽不僅具有抗氧化、降糖等功能[3]，添加鋅可同時促進(jìn)人體生長發(fā)育、增強(qiáng)食欲、增進(jìn)智力、提高免疫力[4]，是一種多功能保健品。

二硫腙比色法[5]也稱雙硫腙比色法，是食品科學(xué)中檢驗和分析鋅含量的一種常用方法[6-7]。本試驗中將分別采用二硫腙比色法一次提取和二次提取來測定核桃多肽口服乳劑中的鋅含量，并對分析方法進(jìn)行驗證[8]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

核桃多肽口服乳劑（武昌理工學(xué)院生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心實驗室提供，批號：20151006，20151103，20151210）；硫酸鋅、醋酸鈉、醋酸、氨水、鹽酸羥胺、硫代硫酸鈉、二硫腙、四氯化碳等，以上均為國產(chǎn)分析純，氧化鋅為基準(zhǔn)試劑，實驗用水為純化水。

UV-1800紫外-可見分光光光度計：日本，Shimadzu；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)烘干箱：上海博訊實業(yè)有限公司；BS224S電子分析天平：德國，Satorius；UPT-11-10T超純水儀：成都超純科技有限公司；SJ-4A pH計：上海精科實業(yè)有限公司；SX2-2.5-10GJ馬弗爐：湖北英山縣建力電爐制造有限公司；HH-S水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.1.1 一次提取法

吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg Zn），分別置于125 mL分液漏斗中，各加水至10mL。分別加一滴甲基橙指示液，用濃氨水調(diào)至由紅變藍(lán)，然后分別加入5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液及1mL硫代硫酸鈉溶液（250 g/L），搖勻后，再各加入10.0mL二硫腙-四氯化碳溶液（含二硫腙0.01 g/L），劇烈振搖4min。靜置分層后，四氯化碳層經(jīng)脫脂棉濾入l cm比色杯中，以四氯化碳調(diào)節(jié)零點，于530 nm處測定吸光度A。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：A=0.557c+ 0.026 1（R2=0.991 1），鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度線性關(guān)系良好，可用于含量測定。

1.2.1.2 二次提取法

吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液（相當(dāng)于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg Zn），分別置于125 mL分液漏斗中，各加鹽酸（0.02mol/L）至20mL。然后分別加入10mL醋酸-醋酸鈉緩沖液及1mL硫代硫酸鈉溶液（250 g/L），搖勻后，再各加入10.0mL二硫腙使用液（含二硫腙0.02 g/mL），劇烈振搖2min。靜置分層后，四氯化碳層經(jīng)脫脂棉濾入1 cm比色杯中，以四氯化碳調(diào)節(jié)零點，于530 nm處測定吸光度A。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：A=0.104 7c-0.100 5（R2=0.999 8），鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度線性關(guān)系良好，可用于含量測定。

1.2.2 試樣處理與測定

1.2.2.1 炭化

量取5.0mL核桃多肽口服乳劑置于瓷坩堝中，按表1加適量的酸，在水浴上蒸干，以小火炭化直至無煙。

表1 酸的種類及比例的確定（樣品量5.0m L）Table1 Determ ination of the typeand proportion of acid（samp lesize5.0m L）

1.2.2.2 灰化

炭化完成后移入馬弗爐中灰化8 h后用硝酸、硫酸混合酸進(jìn)行溶解。設(shè)計9組試驗，確定最佳灰化條件。9組試驗具體條件見表2。

表2 灰化條件試驗Table2 Experimentalconditionsof ashing

1.2.2.3 試樣制備

灰化后取出坩堝冷卻至室溫，加入1.5mL～2.0mL混合酸（體積比為硝酸∶硫酸=3∶1），小火加熱，不使干涸，必要時加少許混合酸，如此反復(fù)處理，直至殘渣中無碳粒，待坩堝稍冷，加10mL質(zhì)量濃度為3.32%的鹽酸，溶解殘渣并定量轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用質(zhì)量濃度為3.32%的鹽酸稀釋至刻度，混勻備用。

1.2.2.4 試樣測定

樣品經(jīng)消化后，在pH4.0～5.5時，鋅離子與二硫腙形成的紫紅色絡(luò)合物可溶于四氯化碳，在530 nm處有最大吸收，與標(biāo)準(zhǔn)系列相比較進(jìn)行定量。體系中加入硫代硫酸鈉，可防止銅、汞、鉛、銀和鎘等離子干擾。

1.2.3 含量測定分析方法的驗證

1.2.3.1 準(zhǔn)確度——回收率試驗

按含量測定濃度的80%、100%、120%設(shè)計3個試驗濃度，分別按處方比例加入輔料和定量的對照品，每個濃度配制3份供試品溶液，照含量測定方法計算含量，按公式（1）計算加入對照品的回收率。

1.2.3.2 精密度

準(zhǔn)確吸取5.0mL消化后定容的樣品溶液，平行操作5次，于530 nm處測吸光度，計算RSD值。

1.2.3.3 線性

線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。配制含量測定濃度80%～120%的5份供試品進(jìn)行一次提取和二次提取，按含量測定方法測定并計算含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣處理

2.1.1 炭化

根據(jù)1.2.2.1試樣處理中炭化的方法，觀察現(xiàn)象，結(jié)果見表3。

表3 炭化現(xiàn)象結(jié)果Table3 Resultsof carbonization phenomenon

由表3可知，7～9號樣品炭化完全，效果較好。因此，炭化時用的混合酸及體積比為硝酸：硫酸（1∶1、2∶1、3∶1）、總用量為0.10mL。

2.1.2 灰化

根據(jù)1.2.2.2試樣處理中灰化正交試驗，觀察現(xiàn)象，結(jié)果見表4。

表4 試樣灰化正交試驗結(jié)果Table4 Resultsoforthogonalsam pleashing

續(xù)表4 試樣灰化正交試驗結(jié)果Continue table4 Resultsof orthogonalsam pleashing

由表4可知，試驗8、9灰化效果好，其中試驗9灰化結(jié)束后得到白色疏松物，效果比試驗8更好。因此，灰化最佳條件為：600℃（8 h），硝酸：硫酸體積比為3∶1。

2.2 樣品的測定

用確定的炭化和灰化最佳條件，處理核桃多肽口服乳劑試樣，分別用一次提取法和二次提取法進(jìn)行鋅含量測定，每個方法測定兩次，分別用c1，c2表示測得的濃度，并取平均值，結(jié)果見表5。

表5 核桃多肽口服乳劑鋅含量測定結(jié)果Table5 Walnut polypep tideoralemulsion zinc content determ ination results μg/mL

2.3 分析方法驗證

2.3.1 回收率試驗

根據(jù)1.2.3.1，分別用一次提取和二次提取法測定樣品的鋅含量，由公式（1）計算回收率，結(jié)果見表6和表7。

表6 一次提取結(jié)果的回收率Table6 Recovery rateof onceextraction

表7 二次提取結(jié)果的回收率Table7 Recovery rateof twiceextraction

由表6和7可知：二次提取的回收率較高，其平均回收率為97.21%～102.21%，準(zhǔn)確度較高。

2.3.2 精密度

在確定的試樣最佳處理條件下，分別用一次提取和二次提取法測定鋅含量，對同一樣品重復(fù)測定5次，并計算RSD值，結(jié)果見表8。

表8 一次提取和二次提取結(jié)果的精密度比較Table8 Com parison of precision of onceextraction and twice extraction

紫外-可見分光光度法含量測定要求RSD≤5%[9-11]，由表8可知：二次提取法測定鋅的精密度符合要求。

2.3.3 線性

按照1.2.3.3中的方法對80%～120%5個濃度的供試品溶液進(jìn)行一次提取，其線性回歸方程為：y= 1.069 0x-0.373 2（R2=0.978 1）；進(jìn)行二次提取，其線性回歸方程為：y=1.388 0x+0.055 4（R2=0.999 3）。因此，二次提取法的線性較好。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，核桃多肽乳劑樣品炭化使用混合酸的種類和體積比為硝酸∶硫酸=3∶1，在600℃灰化8 h。鋅含量測定中，二次提取法較一次提取具有更高的準(zhǔn)確度、精密度和更好的線性，加標(biāo)回收率為97.21%～102.21%，RSD值為2.4%，小于5%，其線性回歸方程相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999以上。因此，可采用二硫腙二次提取法測定核桃多肽口服乳劑中的鋅含量。

[1]沙向陽,王納新,鄧欣.多肽藥物口服給藥的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2012,24(3)：1-5

[2]崔福德.藥劑學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2013：157-164

[3]王瑩,徐秀林,朱乃碩.生物活性肽降血糖功能的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2012,33(9)：341-344

[4]于鳳池.鐵、鋅生理功能及稻米中鐵、鋅含量分布和測定方法的比較研究[J].農(nóng)業(yè)科技通訊,2011(11)：87-88

[5]王竹天,蘭真,魯杰,等.GB/T5009-2003《食品衛(wèi)生檢驗方法》理化部分簡介[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2005,17(3)：193-211

[6]王少玲,彭翠紅.雙硫腙-乳化劑OP光度法測定鋅的研究[J].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報,2014,35(10)：48-51

[7]俞靜,李文秀,王雪楓,等.雙硫腙分光光度法測定水中微量鋅方法的改進(jìn)[J].天津化工,2014,28(1)：36-39

[8]于治國,宋粉云.分析方法的驗證[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2010：213-217

[9]馮東,李雪梅,王丙蓮.紫外-可見分光光度法在食品檢測及食品安全分析中的應(yīng)用[J].食品工業(yè),2013,34(6)：190-192

[10]李蘭英,鄭國金.紫外-可見分光光度法在藥物分析中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(30)：295-297

[11]蘇玉順,李艷君,趙方振,等.紫外-可見分光光度法在植物多糖含量測定中的應(yīng)用[J].光譜實驗室,2011,28(3)：1101-1107

Determ ination of Zinc Concentration in Walnut Polypeptide Oral Emulsion by Dithizone Colorimetry

WUYou1，2，ZHOUHan-li1，2，MEIShuang1，MAMing-lan1，TAN Jun-jun1，ZHANGLin1，LIUYang1，2，*
（1.Engineering Technology Research Centerof BiologicalPeptide AntidiabeticsofHubeiProvince，Synergy Innovation Centerof BiologicalPeptide AntidiabeticsofHubeiProvince，Schoolof Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，Hubei，China；2.SchoolofChemicalEngineeringand Pharmacy，Wuhan Instituteof Technology，Wuhan 430073，Hubei，China）

To establish themeasurementdithizone colorimetry of zinc concentration in walnutpolypeptide oral emulsion.Orthogonalexperimentwasused to confirm the preparationmethod ofsample，then dithizone once extraction and twiceextractionwere to determine the concentration ofzinc，and the two kindsofdithizoneextractionmethodswere verified and compared from the accuracy，precision and linearity.The emulsion sample was carbonized by usingnitric acid and sulfuric acid（the volume ratiowas3 to1），the ash temperaturewas600℃for8 h.Moreover，compared to dithizone once extractionmethod，when the zinc concentrationwaswithin range of5.0μg/mL，the correlation coefficientofdithizone twice extractionmethod wasup to 0.999 8（n=6），ofwhich the recoverywas 97.21%-102.21%，and the RSD=2.4%.The dithizone twice extractionmethod was higher accuracy and precision，which can be utilized to determine the zinc concentration in walnut polypeptide oral emulsion.

walnutpolypeptide；emulsion；zinc；dithizone colorimetry

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.028

2016-08-12

湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（No.201512310016，No.201512310017）

吳悠（1993—），女（漢），碩士研究生，研究方向：植物多肽糖尿病藥物制劑研究。

*通信作者：劉陽，副教授，研究方向：天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。