李志濤，孫金旭，王倩，周紅菊，楚志峰

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北衡水053000）

白靈菇多糖的提取及其免疫活性研究

李志濤，孫金旭，王倩，周紅菊，楚志峰

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北衡水053000）

通過(guò)L18（37）正交試驗(yàn)，研究了物料粒度、料液比、微波功率、微波時(shí)間、提取溫度、微波提取次數(shù)、乙醇與濃縮液比值這7個(gè)因素對(duì)白靈菇多糖得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：物料粒度、料液比、微波功率、微波時(shí)間、微波提取次數(shù)對(duì)白靈菇多糖得率均有顯著地影響。并確定提取白靈菇多糖的最佳參數(shù)為：物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波時(shí)間6min、提取溫度90℃、微波提取次數(shù)3次、乙醇與濃縮液比值4∶1（體積比）。在最佳條件下，白靈菇多糖提取率可達(dá)9.31%。通過(guò)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)表明，在適當(dāng)?shù)膭┝肯?，提取到的白靈菇多糖能明顯提高小鼠的免疫功能。

白靈菇；多糖；提?。幻庖呋钚?/p>

白靈菇是一種珍貴的食藥兩用的大型真菌，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健功能很高。白靈菇多糖為其主要的生物活性成分[1]。目前國(guó)內(nèi)常用熱水法、堿溶液浸提法等方法提取白靈菇多糖[2-3]。但這些提取方法制備工藝繁瑣，提取率也較低，目前，較新型的微波提取法具有操作簡(jiǎn)單、提取率高等優(yōu)點(diǎn)[4]。而采用微波法提取白靈菇多糖的報(bào)道很少，為此，我們采用微波法提取白靈菇多糖，以白靈菇多糖為產(chǎn)物進(jìn)行試驗(yàn)，以期確定提取白靈菇多糖的最佳參數(shù)，提高白靈菇多糖提取率，并對(duì)提取的多糖進(jìn)行免疫活性研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)白靈菇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

白靈菇：衡水學(xué)院食品學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1月齡清潔級(jí)小鼠：購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)，體重為（20±2）g。

無(wú)水乙醇、無(wú)水乙醚、丙酮、苯酚：天津市金衛(wèi)爾化工有限公司；葡萄糖：泰州市興華化學(xué)品有限公司；濃硫酸：石家莊鑫隆威化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

FA1004C型電子天平：上海市平軒科學(xué)儀器公司；722型分光光度計(jì)：上海市美析儀器公司；VIP271型微波爐：順德市惠爾浦蜆華微波制品公司。

1.2 方法

1.2.1 微波法提取白靈菇多糖[5]

1.2.1.1 提取工藝

白靈菇→粉碎（粉碎后分別過(guò)不同孔徑篩網(wǎng)，調(diào)節(jié)物料粒度）→加蒸餾水（調(diào)節(jié)料液比）浸泡20min→微波輻射（分別調(diào)節(jié)微波功率、輻照時(shí)間、提取溫度）→離心得上清液→濃縮至原體積的1/4→加入乙醇沉淀（調(diào)節(jié)乙醇用量與濃縮液比值）→4℃靜置24 h→離心得沉淀→無(wú)水乙醇、丙酮分別洗滌→低溫干燥→白靈菇多糖

1.2.1.2 正交試驗(yàn)

選用物料粒度、料液比、微波功率、微波時(shí)間、提取溫度、微波提取次數(shù)、乙醇與濃縮液比值為試驗(yàn)因素，前期單因素試驗(yàn)研究了這7個(gè)因素對(duì)白靈菇多糖提取的影響。本試驗(yàn)根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，用L18（37）正交表來(lái)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。L18（37）正交表的因素水平見(jiàn)表1。

表1 L18（37）正交試驗(yàn)因素水平表Table1 L18（37）orthogonalexperim entaldesign factorsand level

1.2.1.3 白靈菇多糖的測(cè)定[6]

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖。以葡萄糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值（波長(zhǎng)490 nm）為縱坐標(biāo)，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），回歸方程為：y=6.735 2x，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 2。然后測(cè)定白靈菇多糖樣品吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中的多糖含量。

圖1 苯酚-硫酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curveof phenol-vitriol

1.2.2 白靈菇多糖免疫調(diào)節(jié)活性的測(cè)定[7]

拉頸處死小鼠，無(wú)菌操作下取脾制備成細(xì)胞懸液。在96孔酶標(biāo)板的每個(gè)孔中，加入100μL細(xì)胞懸液，再加20μL完全培養(yǎng)液為陰性對(duì)照；加10μLCon A（刀豆蛋白A），10μL完全培養(yǎng)液為陽(yáng)性對(duì)照；實(shí)驗(yàn)組取白靈菇多糖樣品，分別配制成1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL的溶液，加入10μL樣品溶液和10μLConA于每個(gè)試驗(yàn)孔上，然后置于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2、37℃）中，孵育72 h。在培養(yǎng)結(jié)束前6小時(shí)時(shí)，每孔加10μL新配制的無(wú)菌MTT（噻唑藍(lán)，5mg/mL）。培養(yǎng)結(jié)束以后，每孔加入100μL 10%的SDS（十二烷基硫酸鈉）來(lái)終止反應(yīng)，測(cè)OD490nm值（光密度）。用刺激指數(shù)（Stimulate index，SI）來(lái)表示免疫調(diào)節(jié)活性，SI值越大，說(shuō)明提取的白靈菇多糖的免疫調(diào)節(jié)活性越強(qiáng)。刺激指數(shù)的計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 以白靈菇多糖為目的產(chǎn)物的試驗(yàn)分析

正交試驗(yàn)對(duì)白靈菇多糖得率影響的數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表2、表3。

表2 L18（37）正交試驗(yàn)對(duì)白靈菇多糖得率影響分析Table2 L18（37）Orthogonal testanalysisof the impactof polysaccharide yield

表3 L18（37）正交試驗(yàn)對(duì)白靈菇多糖得率影響的顯著性分析Table3 L18（37）orthogonal testof the impactof significant polysaccharide yield analysis

由表2、表3得知，物料粒度、料液比、微波功率、微波時(shí)間、微波提取次數(shù)對(duì)白靈菇多糖得率均有顯著地影響，其它因素影響不顯著。按各因素對(duì)白靈菇多糖得率的影響的重要性而論：C＞A＞D＞B＞F＞E＞G，即微波功率＞物料粒度＞微波時(shí)間＞料液比＞微波提取次數(shù)＞提取溫度＞乙醇與濃縮液比值。由以上結(jié)果可知微波功率對(duì)白靈菇多糖得率的影響最大，并確定最佳試驗(yàn)組合為A2B1C2D2E3F3G2，即物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波時(shí)間6min、提取溫度90℃、微波提取次數(shù)3次、乙醇與濃縮液比值4∶1（體積比）。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

由2.1確定正交試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B1C2D2E3F3G2，采用此最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，做3個(gè)平行樣，取平均值后計(jì)算多糖得率為9.31%，此結(jié)果與正交試驗(yàn)最高值相比，多糖得率提高6.04%，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果較有意義。

2.3 免疫調(diào)節(jié)活性的測(cè)定

不同濃度的白靈菇多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度的多糖對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)活性的影響Fig.2 Effectsof differentdosagesof sam pleson splenic lym phocyte multiplication

如圖2所示，不同濃度的多糖的刺激指數(shù)均大于1（SI＞1），表明提取的白靈菇多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性具有促進(jìn)作用，因此其對(duì)小鼠具有較好的免疫增強(qiáng)的作用。隨著樣品濃度的提高，其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)樣品濃度在超過(guò)5mg/mL時(shí)，隨著樣品濃度的增加，小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性增加的速度就非常緩慢，其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本文采用微波輔助提取法，通過(guò)正交試驗(yàn)確定提取白靈菇多糖的最佳試驗(yàn)參數(shù)為：物料粒度0.150mm、料液比1∶20（g/mL）、微波功率300W、微波時(shí)間6min、提取溫度90℃、微波提取次數(shù)3次、乙醇與濃縮液比值4∶1。然后按照最優(yōu)組合進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，得白靈菇多糖提取率為9.31%，結(jié)果證明該組合與未優(yōu)化組合相比較，白靈菇多糖得率較高，而且其提取率遠(yuǎn)高于熱水法（提取率為6.39%）或堿溶液浸提法提取的白靈菇多糖提取率（提取率為1.43%）[2-3]。并且通過(guò)免疫調(diào)節(jié)活性實(shí)驗(yàn)得知，在適宜濃度下，白靈菇多糖能明顯的提高小鼠免疫功能，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)活性的功能食品提供了理論基礎(chǔ)。

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A Study on the Extraction and Immune Effect of Polysaccharide from Pleurotus nebrodensis

LIZhi-tao，SUN Jin-xu，WANGQian，ZHOUHong-ju，CHU Zhi-feng
（Departmentof Life Sciences，HengshuiUniversity，Hengshui053000，Hebei，China）

Theeffectofmaterialsize，the ratioofmaterial to liquid，microwave power，microwave time，extraction temperature，times andmultiple of ethanol on the yield of polysaccharide from Pleurotus nebrodensis was studied through L18（37）orthogonal experiment.Orthogonalexperimentanalysis showed thatmaterial size，the ratio ofmaterial to liquid，microwave power，microwave time and timesappreciable impact.The optimum conditionswere：material sizewas 0.150mm，the ratio ofmaterial to liquid was 1∶20（g/mL），microwave power was300W，microwave timewas6min，extraction temperaturewas90℃，timeswas3 andmultiple ofethanol was4∶1（ratiosof the volume）.Under the optimal circumstances，the extraction rate ofpolysaccharide could be up to 9.31%.The experiment of lymphocyte proliferation ofmouse's spleen showed that polysaccharide from Pleurotusnebrodensis atmoderate dose significantly promoted the immunologic function inmice.

Pleurotusnebrodensis；polysaccharides；extraction；immunoregulatoryactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.012

2016-06-15

李志濤（1983—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)。