馮嫣，馬文婷

（呂梁學院生命科學系，山西呂梁033000）

響應面法優(yōu)化靈芝孢子粉多糖提取工藝的研究

馮嫣，馬文婷

（呂梁學院生命科學系，山西呂梁033000）

以靈芝孢子粉多糖為研究對象，通過單因素試驗考察液料比、提取溫度、提取時間3個因素對提取率的影響，確定提取靈芝孢子粉多糖的最優(yōu)工藝參數，并運用響應面法對3個因素進行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的提取工藝，并確定該工藝條件的可靠性和高效性。結果表明：單因素試驗確定提取靈芝孢子粉多糖的最優(yōu)工藝為液料比20∶1（mL/g）、提取溫度80℃、提取時間2 h，在此條件下靈芝孢子粉多糖提取率為4.78%；運用響應面法優(yōu)化工藝參數，確定最佳工藝條件為：液料比21.27∶1（mL/g）、提取溫度80.10℃、提取時間2.10h，在此條件下預測多糖提取率為4.84%；對模型進行驗證，實測結果為4.81%，與擬合方程預測值符合良好。

靈芝孢子；多糖；響應面

近年來，隨著生活水平的日益提高，人們對于健康的關注也越來越高。靈芝屬于一種大型擔子真菌，被我國歷代民族醫(yī)藥視為股本扶正的瑞草，而靈芝孢子作為靈芝的生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質，它富含蛋白質（18.53%）及多種氨基酸（總量為6.1%），還含有豐富的多糖、萜類、生物堿、維生素等成分，其藥理作用主要有抗腫瘤、免疫調節(jié)、調節(jié)血脂以及對神經、心血管和呼吸系統有調節(jié)改善的作用。

隨著近年來對靈芝研究的不斷深入，發(fā)現靈芝多糖是靈芝的主要活性物質之一，其重要性不言而喻。靈芝孢子多糖具有免疫調節(jié)作用、抗腫瘤作用、降血糖作用、抗輻射作用、抗氧化作用以及促進核酸和蛋白質的合成的作用，是一種對人體十分有用的生物活性物質。靈芝多糖主要分布于靈芝孢子中，在比較栽培靈芝與靈芝孢子粉的有效成分含量結果表明，靈芝孢子粉的總多糖數是栽培靈芝總多糖的1.79倍。大量研究報告顯示：靈芝多糖已經成為衡量靈芝產品質量優(yōu)劣的重要指標之一。

本試驗運用響應面法確定水提法提取靈芝孢子多糖的最優(yōu)工藝，為靈芝包子多糖的規(guī)?；崛√峁├碚撘罁蛯嵺`經驗，為靈芝孢子多糖產品的市場化打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

靈芝孢子粉：市售。

1.1.2 試劑

苯酚、三氯乙酸、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸（以上試劑均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器和設備

L400-P3型抽濾器：上海領德儀器有限公司；HWS-26型恒溫水浴鍋：品相科儀（上海）有限公司；SHA-C型振蕩器：城西富威實驗儀器廠；Eppendorf 5810型離心機：德國Eppendorf公司；752-C型紫外分光光度計：上海光學儀器有限公司；FA分析天平：上海方瑞儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

樣品烘干→稱取→乙醇浸泡→抽濾→加水提取→抽濾→濃縮→醇沉→離心分離→沉淀物加水稀釋→丙酮乙醚清洗→樣品烘干→測定多糖含量

1.2.2 多糖提取方法

將靈芝孢子粉在50℃下烘干至恒重，待用。取已烘干的靈芝粉5 g，用95%乙醇浸泡24 h，脫去其中的脂類和低聚糖。將浸泡后的靈芝孢子粉進行真空抽濾，得濾渣。按照液料比，向濾渣中加入適當的水，在設定好溫度的恒溫水浴箱中放置一定時間，進行提取。提取結束后，將其真空抽濾，得濾液，并濃縮至原體積的1/4。濃縮物用95%乙醇在4℃下醇沉12 h。用離心機在6 000 r/min狀態(tài)下離心15min，取沉淀物，加水50mL溶解稀釋，在將沉淀物用丙酮乙醚反復清洗，烘干，取1mL進行多糖含量測定。

1.2.3 多糖含量測定方法

采用苯酚-硫酸法[24-26]。

配置葡萄糖標準溶液，繪制標準曲線，按照苯酚-硫酸法測定靈芝孢子多糖，計算靈芝孢子多糖提取率。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 不同液料比對多糖提取率的影響

分別選取液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），提取溫度為80℃，提取時間為1.5 h，按照1.2.1工藝流程和1.2.2多糖提取方法進行單因素試驗，考察不同液料比對多糖提取率的影響。

1.2.4.2 不同提取溫度對多糖提取率的影響

分別選取提取溫度為60、70、80、90、100℃，固定前面試驗得出的液料比，提取時間為1.5 h，按照1.2.1工藝流程和1.2.2多糖提取方法進行單因素試驗，考察不同提取溫度對多糖提取率的影響。

1.2.4.3 不同提取時間對多糖提取率的影響

分別選取提取時間為1、1.5、2、2.5、3 h，固定前面試驗得出的液料比和提取溫度，按照1.2.1工藝流程和1.2.2多糖提取方法進行單因素試驗，考察不同提取時間對多糖提取率的影響。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗

在單因素的基礎上，確定液料比、提取溫度、提取時間3個因素的零水平，運用Minitab 16數據統計分析軟件，采用Box-Behnken設計，運用三因素三水平響應面分析法，對水解條件進行優(yōu)化設計。試驗因素與編碼見表1。

表1 Box-Behnken設計因素及水平表Table1 Factor levelof orthogonal test

1.2.6 模型驗證試驗

為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用1.2.5響應面優(yōu)化試驗所得結果重復試驗，并將最后結果與預測值進行比較。

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同液料比對多糖提取率的影響

分別選取液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），在提取溫度為80℃、提取時間為1.5 h的條件下進行多糖提取，并計算提取率，考察不同液料比對多糖提取率的影響。結果如圖1所示。

圖1 不同液料比對多糖提取率的影響Fig.1 Effectof liqui-solidd ratio on polysaccharides extraction rate

由圖1可知，當液料比為20∶1（mL/g）時，靈芝孢子粉多糖提取率最高，達到4.3%。液料比為10∶1（mL/ g）時，靈芝孢子粉提取率最低，隨著水比例的增大，提取率也隨之增加，并于20∶1（mL/g）時達到峰值。之后繼續(xù)增加水的比例，提取率趨于平穩(wěn)，并略有下降。加水比例越大，靈芝孢子粉中的多糖越易溶出，因此提取率越高。但是加水比例過大時，會給后續(xù)的濃縮過程帶來不便，耗時耗能，因此不利于后續(xù)的醇沉。故選擇液料比為20∶1（mL/g）。

2.1.2 不同提取溫度對多糖提取率的影響

分別選取提取溫度為60、70、80、90、100℃，在液料比為20∶1（mL/g）、提取時間為1.5 h的條件下進行多糖提取，并計算提取率，考察不同提取溫度對多糖提取率的影響。結果如圖2。

圖2 不同提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effectof temperatureon polysaccharidesextraction rate

由圖2可知，當提取溫度為80℃時，靈芝孢子粉多糖提取率最高，達到4.3%。提取溫度為60℃時，靈芝孢子粉提取率最低，隨著提取溫度的增大，提取率明顯增加，于80℃時達到峰值。之后隨著提取溫度的增加，提取率趨于平穩(wěn)，并略有下降。提取溫度越高，多糖分子的活動越劇烈，多糖更易溶出，因此隨提取溫度的上升，提取率也隨之升高。80℃后，隨著提取溫度的增加，提取液的蒸發(fā)損耗增大，同時高溫可能會破壞糖分子的內部結構和生物活性，因此提取率穩(wěn)中略降。綜上，本試驗選擇提取溫度為80℃。

2.1.3 不同提取時間對多糖提取率的影響

分別選取提取時間為1、1.5、2、2.5、3 h，在液料比為20∶1（mL/g）、提取溫度為80℃的條件下進行多糖提取，并計算提取率，考察不同提取時間對多糖提取率的影響。結果如圖3。

圖3 不同提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effectof tim eon polysaccharidesextraction rate

由圖3可知，當提取時間2 h時，靈芝孢子粉多糖提取率最高，達到4.78%。提取時間為1 h時，靈芝孢子粉提取率最低，隨著提取時間的增加，提取率明顯增加，于2 h時達到峰值。之后隨著提取溫度的增加，提取率趨于平穩(wěn)，并略有下降。提取時間越長，多糖溶量越大，當提取2 h后，多糖提取率不再增加，說明提取液中的多糖分子達到平衡。同時過長的浸泡時間可能會導致多糖分子內部結構的破壞，導致提取率降低。因此選擇提取時間為2 h。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 試驗結果及方差分析

運用Minitab 16數據統計分析軟件試驗數據進行多元回歸擬合，并進行方差分析，響應面法的試驗設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗結果Table2 Experim ent results

續(xù)表2 Box-Behnken試驗結果Continue table2 Experim ent results

通過回歸分析，得到靈芝孢子粉多糖提取率與液料比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）的二次多項回歸模型：

回歸方程系數顯著性檢驗表見表3。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗表Table3 Tableof coefficientsof regression equation

由回歸方程系數顯著性檢驗表（表3）可知，模型的二次項X1X2對響應值具有顯著影響，其他項對響應值具有極顯著影響，表明各因素對多糖提取率的影響具有線性關系。

回歸模型方差分析表見表4。

表4 回歸模型方差分析表Table4 Tableof varianceanalysisof regressionm odel

對數據進行方差分析，結果（表4）顯示模型的P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬項P=0.181 9＞0.01，不顯著；模型的調整R2=0.935 3，該模型能夠解釋93.53%的響應值變化，說明該模型擬合度較好，試驗誤差較小，能夠用該模型來對靈芝孢子粉多糖的提取率進行分析和預測。

2.2.2 響應面分析

根據上述模型，每兩個因素對提取率畫出響應面曲線和等高線，結果見圖4～圖6。

圖4 液料比和提取溫度對提取率影響的響應面曲線及等高線Fig.4 Response surface curvesand contour linesof the influenceof liquidmaterial ratio and extraction tem peratureon extraction rate

響應面和等高線圖等高線的形狀反映出交互效應的強弱和大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示交互作用顯著。

分析比較3個圖可知，液料比（X1）對提取率影響最為顯著，表現為曲線較陡，而提取時間（X3）和提取溫度（X2）次之。三因素之間交互作用均顯著。

通過軟件分析，水提法提取靈芝孢子粉多糖的最佳工藝條件為：液料比21.27∶1（mL/g）、提取溫度80.10℃、提取時間2.10 h，在此條件下預測多糖提取率為4.84%，工藝參數基本接近本研究中單因素試驗所選取的數值。

2.2.3 模型驗證試驗

為檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件靈芝孢子多糖提取試驗，在此條件下實際提取率為4.81%，與理論值比較誤差為0.62%，相對誤差較小。因此，基于單因素試驗的響應面法優(yōu)化工藝參數，方法可行可靠，具有實用價值。

圖5 液料比和提取時間對提取率影響的響應面曲線及等高線Fig.5 Response surface curvesand contour linesof the influenceof liquidmaterial ratio and extraction timeon extraction rate

圖6 提取溫度和提取時間對提取率影響的響應面曲線及等高線Fig.6 Effectof temperatureand extraction tim eon theextraction rateof responsesurface curvesand contour lines

3 結論

國內關于植物多糖提取的研究較為充分，但對于以靈芝孢子粉多糖為提取對象的研究還不夠系統。本試驗運用水提法提取靈芝孢子粉多糖，通過單因素試驗和響應面優(yōu)化確定水提醇沉法提取靈芝孢子粉多糖的最優(yōu)工藝條件，顯著提高靈芝孢子粉多糖的提取率，并確定該方法的高效性。具體結論如下：

1）通過單因素試驗確定水提法提取靈芝孢子粉多糖的最佳提取條件為：液料比20∶1（mL/g）、提取溫度80℃、提取時間2 h。在此條件下，靈芝孢子粉多糖提取率為4.78%。

2）運用響應面法試驗對試驗數據進行多元回歸擬合，得到靈芝孢子粉多糖提取率與液料比（X1）、提取溫度（X2）、提取時間（X3）的二次多項回歸模型：Y=－45.66+1.03X1+0.85X2+4.88X3－7.00×10-4X1X2+0.03X1X3－0.02X2X3－0.03X12－4.89×10-3X22－0.87X32。對數據進行方差分析，結果表明該模型擬合度較好。

3）通過響應面曲面及等高線分析可知，液料比（X1）對提取率影響最為顯著，表現為曲線較陡，而提取時間（X3）和提取溫度（X2）次之。三因素之間交互作用均顯著。

4）運用此模型進行對試驗進行工藝條件優(yōu)化，最佳工藝條件為：液料比21.27∶1（mL/g）、提取溫度80.10℃、提取時間2.10 h，在此條件下預測多糖提取率為4.84%。

5）采用響應面優(yōu)化條件靈芝孢子粉多糖提取試驗，在此條件下實際提取率為4.81%，與理論值比較誤差為0.62%，相對誤差較小。因此應用此模型得出的工藝參數準確可靠，具有一定的實用價值。

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Optim ization of Extraction Process of Polysaccharide from Lucidum Spores Using Response Surface Analysis

FENGYan，MAWen-ting
（Departmentof Life Sciences，Luliang University，Luliang033000，Shanxi，China）

This paper concentrate on GLSPs，the optimum process parameters of extracting GLSPswere determined through single factor experiment，in which the three factors that influence the extraction yield ofGLSPs（including the ratioofwater tomaterial，theextraction temperatureand theextraction time）were controlled and tracked.At the same time，the response surfacemethod was used to optimize the three factors and lead to the optimized extraction processaswellas to determine the reliability and efficiency of thisoptimized process conditions.The single factor experiments showed that the optimized processofextracting GLSPswas as follows：the ratioofwater tomaterialwas20∶1（mL/g），theextraction temperaturewas80℃and theextraction timewas2 hours.Under such condition，the extraction yield of GLSPswas 4.78%；By using the response surfacemethod to optimize the processparameters，the optimized processofextracting GLSPswasas follows：the ratio ofwater tomaterialwas 21.27∶1（mL/g），the extraction temperature was 80.10℃and the extraction time was 2.10 hours.Undersuch condition，theextraction yield ofGLSPswas4.84%；To verify thismodel，themeasured resultwas4.81%，and the developed regressionmodel could experimentaldatawelland wasqualified.

lucidum spores；polysaccharide；responsesurfacemethodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.011

馮嫣（1986—），女（漢），助教，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。