肖春玲，田理剛，岳思遠(yuǎn)，郭毅晶，高媛，李凱婭

（山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004）

不同色澤花生衣抗氧化活性研究

肖春玲，田理剛，岳思遠(yuǎn)，郭毅晶，高媛，李凱婭

（山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004）

為研究不同色澤花生衣的抗氧化能力，分別測(cè)定紅色、粉紅色、黑色花生衣的總酚、總黃酮含量，并建立二苯代苦味?；杂苫―PPH·）體系、羥基自由基（·OH）體系、三價(jià)鐵還原力體系、亞鐵離子螯合體系，測(cè)定并對(duì)比3種不同色澤花生衣的抗氧化能力。結(jié)果表明：紅色花生衣的抗氧化活性最強(qiáng)，對(duì)羥自由基、DPPH自由基的半抑制濃度IC50分別為0.046 1、0.005 17mg/mL；粉紅色花生衣的抗氧化活性次之，對(duì)羥自由基、DPPH自由基的半抑制濃度IC50分別為0.098 4、0.006 43mg/mL；而黑色花生衣的抗氧化活性相對(duì)稍差，對(duì)羥自由基、DPPH自由基的半抑制濃度IC50分別為0.161 7、0.00678mg/mL。3種不同色澤花生衣都具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是效果較好的天然抗氧化劑。

不同色澤花生衣；總酚；總黃酮；抗氧化活性

花生在我國(guó)產(chǎn)量巨大，花生衣作為花生加工過(guò)程中的副產(chǎn)物之一，其產(chǎn)量也十分巨大，據(jù)折算我國(guó)花生衣年產(chǎn)約18萬(wàn)t，而其商業(yè)價(jià)值十分低廉?；ㄉ轮泻胸S富的酚類物質(zhì)，具有較高的抗氧化活性，可以作為天然抗氧化劑[1]?；ㄉ潞胸S富的營(yíng)養(yǎng)成分，并有止血、散瘀、消腫的功效，臨床上有廣泛的應(yīng)用。中醫(yī)理論認(rèn)為，“脾統(tǒng)血”，氣虛的人就容易出血，花生紅衣正是因?yàn)槟軌蜓a(bǔ)脾胃之氣，所以能達(dá)到養(yǎng)血止血的作用，這在中醫(yī)上講叫“補(bǔ)氣止血”。西醫(yī)認(rèn)為，花生紅衣能抑制纖維蛋白的溶解，增加血小板的含量，改善血小板的質(zhì)量，改善凝血因子的缺陷，加強(qiáng)毛細(xì)血管的收縮機(jī)能，促進(jìn)骨髓造血機(jī)能[2]。原花色素由兒茶素、表兒茶素聚合而成，具有很強(qiáng)的生物活性，其主要的生理活性表現(xiàn)為能夠清除人體內(nèi)過(guò)剩的自由基，提高人體的免疫能力，并具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分，可用作安全無(wú)毒的新型天然抗氧化劑[3]。

本文通過(guò)建立不同的抗氧化體系[4]，測(cè)定并對(duì)比3種不同色澤花生衣的抗氧化能力，為不同色澤花生衣的深加工提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

1.1 試驗(yàn)原料

大白沙花生衣，四粒紅花生衣，黑花生衣都購(gòu)自山西臨汾堯豐市場(chǎng)，產(chǎn)地東北。

1.2 試驗(yàn)試劑

三羥甲基氨基甲烷：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Folin-Ciocalteu：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚：天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所；沒(méi)食子酸，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）Sigma公司；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；硝酸銀：天津市邁斯科化工有限公司；鄰菲羅啉、鹽酸、氫氧化鈉、三氯甲烷、無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、水楊酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；JA2603B型電子天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FZ102型微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司；DKL（FC）-4遠(yuǎn)紅外電熱食品烤爐：廣東多利食品機(jī)械廠；DT5-4B型低速臺(tái)式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 花生衣預(yù)處理

將購(gòu)置的花生（去殼）裝入載物盤，放入烘箱中，在60℃恒溫下烘干2 h后取出。采用直接分離法，將花生紅衣剝落，放入載物袋，用粉碎機(jī)粉碎至40目～60目，密封存裝，并將之置于棕色瓶中陰涼干燥處貯藏，備用。

2.2 不同色澤花生衣提取液的制備

準(zhǔn)確稱取不同色澤的花生衣粉末5 g各3份放入3個(gè)錐形瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇為溶劑提取花生衣酚類物質(zhì)。提取條件為：60℃恒溫水浴，提取時(shí)間2 h，料液比1∶15（g/mL），取上清液，殘?jiān)僖粤弦罕?∶15（g/mL）加入提取劑60℃水浴2 h[5]。合并兩次提取液，殘?jiān)^(guò)濾，提取液在4 000 r/min的條件下離心15min分離得上清液，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮得三種不同色澤花生衣酚類物質(zhì)粗提物，定容至25mL，得供試液，放入冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 多酚的測(cè)定

2.3.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精確稱量沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25mg，用蒸餾水溶解后定容于250mL容量瓶，得到0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別移取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.00、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50mL置于25mL具塞比色管，分別加入1mLFolin酚試劑，搖勻后再分別加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25mL，搖勻。室溫下避光反應(yīng)2 h后，在波長(zhǎng)為765 nm處測(cè)定吸光度，平行3組，取平均值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。得到回歸方程：Y=4.330 5X+0.017 9（R2=0.995 9，0～0.16mg/mL）。

2.3.2 總酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確量取待測(cè)樣品液0.1mL，加80%的乙醇稀釋10倍。準(zhǔn)確吸取不同色澤花生衣稀釋的樣液各1mL，加入1mLFolin酚試劑，搖勻后再加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的Na2CO3溶液，定容至25mL，搖勻后在室溫下避光反應(yīng)2 h后，在波長(zhǎng)為765 nm處測(cè)定吸光度值，并將其數(shù)值帶入沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算總酚含量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，分別平行取樣。以蒸餾水做空白。

2.4 黃酮的測(cè)定

2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取蘆丁藥品0.061 5 g，用80%的乙醇溶液溶解，定容至250mL，得到單位體積溶質(zhì)質(zhì)量濃度為0.246mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中，依次加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻放置6min后，加入10%的硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻，放置6min后再加入5%的氫氧化鈉溶液4mL，用80%的乙醇溶液定容10mL，搖勻，放置15min后在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。得回歸方程Y=0.582 5X+0.017 6（R2=0.994 7，0～1.4mg/mL）。

2.4.2 總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確量取待測(cè)樣品液0.1mL，加80%的乙醇稀釋10倍。準(zhǔn)確吸取不同色澤花生衣稀釋樣液各1mL，分別加入5%的NaNO2溶液0.5mL，搖勻后放置6min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.5mL，搖勻后放置6min，再加入5%的NaOH溶液4mL，定容至10mL，搖勻后放置15min，用80%的乙醇作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。并將其數(shù)值帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算總黃酮含量。

2.5 抗氧化活性的測(cè)定

2.5.1 二苯代苦味?；杂苫―PPH·）清除能力的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取24mg DPPH，用無(wú)水甲醇溶解并定容于250mL容量瓶中，DPPH濃度為60μg/mL，避光保存（0～4℃）；分別吸取不同色澤花生衣提取樣液用80%乙醇稀釋成不同倍數(shù)。分別吸取0.5mL不同色澤花生衣稀釋樣液于試管中，分別加入2.5mLDPPH·液混合搖勻，避光反應(yīng)30min，在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，取平均值?？瞻捉M用80%乙醇代替樣液，同時(shí)做顏色對(duì)照，對(duì)照組用80%乙醇代替DPPH溶液。計(jì)算不同色澤花生衣樣液對(duì)DPPH·清除率。DPPH·清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100%。式中：A0為0.5mL 80%乙醇和2.5mLDPPH溶液的吸光值；A1為0.5mL樣品溶液和2.5mLDPPH溶液的吸光值；A2為0.5mL樣品溶液和2.5mL 80%乙醇的吸光值。

2.5.2 羥基自由基（·OH）清除能力的測(cè)定

利用過(guò)氧化氫和鐵離子混合產(chǎn)生羥自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)。反應(yīng)體系中含8.8mmol/L H2O21 mL、9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL、不同色澤花生衣提取液的稀釋液1 mL。在37℃反應(yīng)0.5 h，以80%乙醇為空白，在510 nm處測(cè)量不同色澤花生衣提取液的吸光度?？紤]到不同色澤花生衣提取液的吸光度，以9mmol/LFeSO41mL、8.8mmol/LH2O21mL、不同色澤花生衣提取液1mL和1mL蒸餾水在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度作為花生衣提取液的本底吸光度[8-9]。

式中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A1為加入不同色澤花生衣提取液的吸光度；A2為不加水楊酸-乙醇溶液的不同色澤花生衣提取液本底的吸光度。

2.5.3 Fe2+螯合能力的測(cè)定

分別吸取不同色澤花生衣提取樣液用80%乙醇稀釋成不同倍數(shù)，取不同稀釋倍數(shù)提取樣液1mL于試管中，分別加入2mL 0.2%FeSO4溶液，37℃恒溫水浴30min，然后加入0.5mL 0.3%鄰二氮菲，在37℃恒溫水浴中反應(yīng)10min，各加20mL蒸餾水。在510 nm處測(cè)定吸光值，設(shè)空白對(duì)照為A0，樣液的吸光值為A1，不加鄰二氮菲時(shí)溶液的吸光值為A2，平行測(cè)試3次，計(jì)算Fe2+的螯合率[8]。

2.5.4 還原力的測(cè)定

采用普魯士蘭法測(cè)定黑花生衣色素的還原能力：取一定濃度的樣品水溶液0.5mL，加入0.2mol/L、pH= 6.6的混合磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL并混合均勻，混合液在50℃下反應(yīng)20min后自然冷卻。冷卻完后，在室溫下加入2.5mL、10%三氯乙酸溶液，接著以4 000 r/min的速度離心10min。然后取2.5mL上清液，加入2.5mL的蒸餾水，最后加入1mL 0.1%的FeCl3溶液，混合均勻，10min后測(cè)定700 nm處吸光度。重復(fù)3次，取平均值。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同色澤花生衣中的總黃酮、總酚含量

不同色澤花生衣中總黃酮、總酚含量的測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 不同色澤花生衣總多酚含量Fig.1 Totalpolyphenolcontentof peanut skin With various colors

圖2 不同色澤花生衣黃酮含量Fig.2 Contentof flavonoidsof peanut skin with variouscolors

由圖1可知，3種不同色澤花生衣中總多酚含量不等，紅色花生衣總多酚單位質(zhì)量比最高，其次是粉紅色花生衣，黑色花生衣多酚含量最低。由圖2可知，在同一條件下，不同色澤花生衣的總黃酮含量不等，粉紅色花生衣的總黃酮含量略高于紅色花生衣，黑色花生衣的總黃酮含量最低。

3.2 不同色澤花生衣提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力

自由基清除劑可提供電子與DPPH·的單電子配對(duì)，DPPH·被還原并使其顏色變淺，在516 nm波長(zhǎng)處的吸光度值變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系，故此，用清除率來(lái)表示抗氧化效果，如果清除率越大，則抗氧化能力就越強(qiáng)[9]。表1表示了不同色澤花生衣提取液清除DPPH回歸方程及IC50值比較。

表1 不同色澤花生衣提取液清除DPPH回歸方程及IC50值比較Table1 The regression equation of scavenging DPPH free radicals by peanutskinWith variouscolorsn and com parison of IC50value

由表1可知紅色花生衣提取液的IC50最高，粉紅色花生衣和黑色花生衣提取液的IC50相差無(wú)幾。

3.3 不同色澤花生衣的提取液對(duì)羥基自由基的清除能力

羥自由基是氧化能力很強(qiáng)的自由基，在活性氧中其化學(xué)性質(zhì)最活潑，反應(yīng)性極強(qiáng)，壽命很短，是自由基中已知的最強(qiáng)氧化劑，幾乎可以與任何大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸）等發(fā)生作用而造成損害，而這種損傷是癌癥啟動(dòng)和促進(jìn)的基礎(chǔ)。·OH在細(xì)胞內(nèi)可由H2O2與Fe2+或Cu2+反應(yīng)生成，從而對(duì)細(xì)胞造成毒害作用。是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基。不同色澤花生衣清除DPPH自由基的效果見(jiàn)表2。

表2 不同色澤花生衣提取液清除羥自由基回歸方程及IC50值比較Table2 The regression equation of scavenging hydroxyl radical by peanut skin With variouscolorsand comparison of IC50value

由表2可得紅色花生衣的IC50＞粉紅色花生衣的IC50＞黑色花生衣的IC50。

3.4 不同色澤花生衣提取液Fe2+螯合力的比較

一些金屬離子在脂質(zhì)的氧化過(guò)程中起催化作用，因此可螯合金屬的物質(zhì)能間接地起到抗氧化作用。鄰二氮菲能夠與Fe2+形成紫紅色的絡(luò)合物，當(dāng)有其他螯合劑存在時(shí)，紫紅色變淺，因此可通過(guò)吸光值的變化，評(píng)價(jià)物質(zhì)對(duì)Fe2+的螯合能力。本試驗(yàn)對(duì)不同色澤花生衣粗提物的螯合能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同色澤花生衣提取液Fe2+螯合力Fig.3 Ferrous ion chelating ability of peanut skin With various colors

從圖3中可以看出，花生衣粗提物對(duì)Fe2+具有一定的螯合能力。3種花生衣Fe2+螯合力隨濃度的變化趨勢(shì)一致，都隨著濃度的下降而下降，但是在相同濃度條件下，粉紅色花生衣的Fe2+螯合力最高。其次為黑色花生衣，紅色花生衣Fe2+螯合力最低。但在稀釋至100倍后的黑花生衣的Fe2+螯合力低于紅色花生衣的Fe2+螯合力且此后一直呈現(xiàn)這種趨勢(shì)?？傮w上可得三種不同色澤花生衣的Fe2+螯合力相差不大，呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)。

3.5 不同色澤花生衣提取液的還原能力

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，還原力大的樣品，是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子除了可使Fe3+還原為Fe2+外，亦可與自由基反應(yīng)，使自由基成為較穩(wěn)定的物質(zhì)[10]。許多研究證實(shí)抗氧化活性同還原力是密切相關(guān)的。一般情況下，樣品的還原能力與抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性，本文對(duì)不同色澤花生衣粗提物的還原能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同色澤花生衣提取液對(duì)Fe3+的還原能力Fig.4 Reduction Power of peanut skin with various colors

由圖4可知，隨著濃度的增大，不同色澤花生衣提取液的吸光值不斷升高，還原能力在不斷的增強(qiáng)，說(shuō)明樣品濃度越大，對(duì)三價(jià)鐵離子的還原作用越強(qiáng)，紅色花生衣的還原力大于其余兩種色澤的花生衣，其次是粉紅色花生衣，黑色花生衣的還原力最小。

4 結(jié)論

花生衣中含有黃酮類和多酚類等生理活性物質(zhì)，具有抗氧化的作用。3種不同色澤花生衣提取液均具有一定的抗氧化活性。在羥自由基、DPPH自由基、鐵還原力3個(gè)不同的抗氧化體系中，紅色花生衣提取液的抗氧化活性始終最強(qiáng)，對(duì)羥自由基、DPPH自由基的半抑制濃度IC50分別為0.046 1、0.005 17mg/mL；粉紅色花生衣提取液的抗氧化活性次之，對(duì)羥自由基、DPPH自由基的半抑制濃度IC50分別為0.098 4、0.006 43mg/mL；而黑色花生衣提取液的抗氧化活性相對(duì)稍差，對(duì)羥自由基、DPPH自由基的半抑制濃度IC50分別為0.161 7、0.006 78mg/mL；在Fe2+螯合力體系中粉紅色花生衣的螯合率最大，其次為黑色花生衣，紅色花生衣螯合率稍低，但三者螯合率相差不大。由4個(gè)抗氧化體系可得紅色花生衣的抗氧化活性最強(qiáng)，粉紅色次之，黑色花生衣抗氧化活性相對(duì)較低，這與3種不同色澤花生衣提液中總多酚含量的高低排序相一致，表明多酚類物質(zhì)在花生衣提取液的抗氧化活性中有重要作用。

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Research on Antioxidant Activity of Peanut Skin With Various Colors

XIAOChun-ling，TIAN Li-gang，YUESi-yuan，GUOYi-jing，GAOYuan，LIKai-ya
（Schoolof Food Science，ShanxiNormalUniversity，Linfen 041004，Shanxi，China）

For the study of peanut skin with various colors of antioxidant capacity，red，pink，black peanuts were separatelymeasured the totalphenoland flavonoids content，and establish the bitter acyl diphenylgeneration system of free radical（DPPH·）and hydroxyl radical（·OH）system，ferric iron reduction force system，the ferrous ion chelating system，measuring and comparing three peanutskin with various colors antioxidant capacity.The results showed that the strongestantioxidantactivity of red peanuts，half inhibitory concentration of hydroxyl radicals，DPPH free radicals IC50were 0.046 1，0.005 17 mg/mL；pink peanuts garment antioxidant activity times，half inhibitory concentration of hydroxyl radicals，DPPH free radicals IC50were 0.098 4，0.006 43mg/mL；and antioxidantactivity ofblack peanutsare relatively less，half inhibitory concentration ofhydroxyl radicals，DPPH free radicals IC50were 0.161 7 and 0.006 78mg/mL.Three peanut skin with variouscolorshasstrongantioxidantactivity，isagood naturalantioxidanteffect.

peanutskinwith variouscolors；totalphenol；total flavonoids；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.003

2016-03-25

山西師范大學(xué)質(zhì)量工程項(xiàng)目（SD2015CXXM-59）

肖春玲（1966—），女（漢），教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的提取。