高瑞苑，武樂晨，張海容

（忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

HPLC-PDA法測定食品中微量蘇丹紅Ⅲ

高瑞苑，武樂晨，張海容

（忻州師范學(xué)院生化分析技術(shù)研究所，山西忻州034000）

建立了利用高效液相色譜（HPLC）-二極管陣列檢測器（PDA）法測定食品中蘇丹紅Ⅲ的方法。采用的色譜條件為：Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），用乙腈-丙酮（80-20）：水=95∶5作為流動相，檢測波長為504 nm，流動相流速為1.0mL/min，柱溫為15℃。利用色譜檢測蘇丹紅Ⅲ的濃度在0.03μg/mL～101.86μg/mL時，組分的峰面積與濃度之間線性關(guān)系良好，蘇丹紅Ⅲ的線性方程為A=26 310ρ-911.78（ρ：μg/mL），R2=0.999 2。該方法精密度良好，穩(wěn)定性較強(qiáng)。檢測的4種樣品的加標(biāo)回收率在97.33%～100.00%之間，符合測定要求。高效液相色譜法，方法準(zhǔn)確，快速，適用于蘇丹紅Ⅲ的測定。通過質(zhì)譜，進(jìn)一步驗(yàn)證了食品中蘇丹紅Ⅲ的存在。利用質(zhì)譜檢測到，蘇丹紅Ⅲ的分子離子峰為m/z 353，主要碎裂成m/z156和m/z197。

高效液相色譜；質(zhì)譜；蘇丹紅Ⅲ；食品

蘇丹紅Ⅲ是一種親脂性含萘偶氮化工合成染色劑，有染紅功能，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其列為三類致癌物，即動物致癌物，將其初級代謝產(chǎn)物4-氨基偶氮苯列為二類致癌，即人類致癌物[1]。但因其價格低廉，被不法商家利用，添加到食品中，比如在辣椒制品添加蘇丹紅Ⅲ，以增添紅色色澤，在蛋禽類飼料中添加蘇丹紅Ⅲ，以增添蛋黃的色澤。實(shí)際上，早在1996年，我國食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中就明令禁止使用蘇丹紅類染色劑（主要包括蘇丹紅I～I(xiàn)V），但由于當(dāng)時缺少檢測技術(shù)和統(tǒng)一安全標(biāo)準(zhǔn)，無法解決宏觀的評估問題[2-3]。目前，世界各國在使用色素作為添加劑時，都明確規(guī)定了限量，其安全問題不容忽視。

二十一世紀(jì)以來，國內(nèi)外關(guān)于蘇丹紅I～I(xiàn)V的檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、分子印跡固相萃取法、毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜法、電離質(zhì)譜同位素稀釋法等。這些方法已應(yīng)用于辣椒制品、調(diào)味品、熟食、蛋禽類制品等食品中蘇丹紅I～I(xiàn)V的殘留檢測工作[4-10]，大多都是同時測定蘇丹紅I～I(xiàn)V 4種物質(zhì)，4種物質(zhì)之間是否存在測定干擾，就不得而知了。二極管陣列檢測器可以快速掃描被測組分的光譜圖和色譜圖，根據(jù)食品中蘇丹紅III組分的保留時間和吸收光譜與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和吸收光譜比較，可以對蘇丹紅III進(jìn)行精確的定性、定量分析[11]。因此，本文選擇運(yùn)用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-PDA）法對食品中蘇丹紅III進(jìn)行測定，最后利用質(zhì)譜進(jìn)一步定性驗(yàn)證蘇丹紅III的存在。

1 儀器與試劑

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純）、正己烷、石油醚、乙醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜所用水為超純水，其他均為二次蒸餾水；丙酮（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；蘇丹紅III（生物染色劑）、中性氧化鋁（100目～300目75%層析）：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

樣品：干辣椒、辣椒面、家雞蛋、普通雞蛋均購至忻州市團(tuán)結(jié)市場；腐乳、辣椒醬、香辣醬：忻州市華美超級商場。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 600E高效液相色譜儀、Waters 2998二極管陣列檢測器：美國Waters公司；LC-MS 8030液質(zhì)聯(lián)用儀、UV-1800型紫外可見分光光度計：日本島津公司；KQ-400K型高功率超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TDL-40B離心機(jī)：金壇市友聯(lián)儀器研究所；SPX-150-Z振蕩培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：504 nm；柱溫：15℃；流動相：乙腈-丙酮（80-20）：水=（95∶5），過0.45 μm濾膜后使用。

1.3.2 質(zhì)譜條件

色譜柱：Inert Sustain C色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相0.1%甲酸水溶液∶乙腈=15∶85；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫40℃；毛細(xì)管電壓4.5 kV（ESI+）；DL溫度250℃；Heat Block溫度200℃；霧化氣流速1.5 L/min；干燥氣流速6 L/min；掃描范圍：一級質(zhì)譜340 m/z～360 m/z，二級質(zhì)譜100 m/z～400 m/z。

1.3.3 對照品溶液的配制

精密稱取蘇丹紅Ⅲ0.050 9 g，用乙腈溶解并定容到500 mL的容量瓶，得到101.80 μg/mL的混合溶液，避光，4℃下保存。

1.3.4 供試品溶液的制備[12]

干辣椒提取液：將干辣椒磨碎，過60目篩后，稱取9.980 0g于100 mL錐形瓶中，加入50 mL正己烷，振蕩10 min，超聲15 min，靜置，過濾。取15 mL濾液注入氧化鋁柱中，待溶液全部流出后，泵入10 mL丙酮，洗脫，再用15 mL 98%甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，乙腈溶解至25 mL，過0.45 μm濾膜后，儲存?zhèn)溆谩?/p>

辣椒面提取液：稱取10.010 0 g于100 mL錐形瓶中，加入50 mL正己烷，振蕩10 min，超聲15 min，靜置，過濾。取15 mL濾液注入氧化鋁柱中，待溶液全部流出后，泵入10 mL丙酮，洗脫，再用15 mL 98%甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，乙腈溶解至10 mL，過0.45 μm濾膜后，儲存?zhèn)溆谩?/p>

辣椒醬提取液：稱取20.180 0 g于100 mL錐形瓶中，其余步驟同辣椒面提取液制備。

香辣醬提取液：稱取20.200 0 g于100 mL錐形瓶中，其余步驟同辣椒面提取液制備。

腐乳提取液：稱取20.000 0 g于100 mL錐形瓶中，其余步驟同辣椒面提取液制備。

雞蛋提取液：分別稱取家雞蛋、普通雞蛋19.9700g、20.000 g，各置于50 mL離心管中，均加入30 mL乙腈，高速勻漿1 min，超聲提取10 min，中速振蕩5 min，離心5 min，將上層乙腈層轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶中，用乙腈重復(fù)提取3次，每次20 mL，合并乙腈層，45℃減壓濃縮，用丙酮少量多次轉(zhuǎn)移殘留物并定容至10 mL，混勻，過0.45 μm濾膜，儲存?zhèn)溆肹1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取對照品溶液0.015、0.15、1.5、5、7、10、15、50 mL用乙腈定容到 50 mL得到 0.03、0.31、3.05、10.18、14.25、20.36、30.54、101.80 μg/mL的溶液。在“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，A=26 310ρ-911.78（ρ：μg/mL），R2=0.999 2。因此，在0.03 μg/mL～ 101.86 μg/mL范圍內(nèi)，蘇丹紅Ⅲ的濃度和峰面積呈良好的線性關(guān)系（見圖1），保留時間在12.8 min（見圖2）。

圖1 蘇丹紅Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of SudanⅢ

圖2 蘇丹紅Ⅲ對照品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of reference substance SudanⅢ

2.2 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液6 mL稀釋到50 mL，過膜后轉(zhuǎn)入樣品瓶，在“1.3.1”色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.357%，表明此方法精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對照品溶液8.3 mL稀釋到50 mL，過膜后轉(zhuǎn)入樣品瓶，在“1.3.1”色譜條件下，室溫放置0、2、4、6、8、16、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果24 h內(nèi)峰面積基本不變，計算RSD為0.98%，表明蘇丹紅Ⅲ穩(wěn)定性良好。

2.4 樣品含量測定

取干辣椒、辣椒面、辣椒醬、香辣醬、腐乳、家雞蛋、普通雞蛋的供試品溶液依次進(jìn)樣，在“1.3.1”色譜條件下測定蘇丹紅Ⅲ的含量，測定結(jié)果見表1，其中辣椒醬、香辣醬、腐乳3種樣品中沒有檢測到蘇丹紅Ⅲ，干辣椒中蘇丹紅Ⅲ含量較高，辣椒面、家雞蛋和普通雞蛋中蘇丹紅Ⅲ含量較低。

表1 7種樣品中蘇丹紅Ⅲ含量測定結(jié)果Table 1 Determination results of SudanⅢcontent in seven kinds of samples

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取一定量4種含有蘇丹紅Ⅲ的樣品，加入適量蘇丹紅Ⅲ對照品溶液，按“1.3.4供試品溶液的制備”方法處理，在“1.3.1”色譜條件下測定，并計算回收率和RSD，結(jié)果見表2。

表2 4種樣品的加樣回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and RSDs of four kinds of samples

2.6 質(zhì)譜檢測樣品中蘇丹紅Ⅲ

通過一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜掃描，得到蘇丹紅Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品和測定樣品中蘇丹紅Ⅲ的分子離子峰為m/z 353，主要碎裂成m/z156和m/z197（見表3）。由此分析，蘇丹紅Ⅲ的質(zhì)譜碎裂方式如圖3。

表3 蘇丹紅Ⅲ的質(zhì)譜檢測結(jié)果Table 3 The results of SudanⅢmass spectrometry detection

圖3 蘇丹紅Ⅲ的質(zhì)譜碎裂示意圖Fig.3 The fragmentation pattern of[M+H]+ions of SudanⅢ

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的確定

利用紫外可見分光光度計測定蘇丹紅Ⅲ的紫外吸收光譜，見圖4。

圖4 蘇丹紅Ⅲ的紫外吸收光譜Fig.4 UV-absorption spectra of SudanⅢ

蘇丹紅Ⅲ在348 nm和504 nm處有最大吸收，由于504 nm處的吸收強(qiáng)于348 nm處，因此選擇504 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

嘗試乙酸水-乙腈體系，保留時間在20 min～40 min左右，時間較長，且峰寬較寬、有拖尾。乙酸水-甲醇體系保留時間依然較長，較乙酸水-乙腈體系，峰寬變寬，拖尾前移。兩種體系比較，乙酸水-乙腈體系更有優(yōu)勢，但保留時間均較長，而且乙酸的加入并不能消除拖尾，因此考慮有機(jī)相中加入丙酮，乙酸水換成水。乙腈-丙酮-水體系保留時間大大縮短，且峰形較好。隨著乙腈比例的增加，保留時間推后，但乙腈-丙酮（75-25）∶水=95∶5時有拖尾，而以乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5時，保留時間適中，峰形對稱。

乙腈-丙酮（80-20）∶水不同比例時，隨著有機(jī)項(xiàng)比例的增加，保留時間縮短，峰寬縮小，但流動相為乙腈-丙酮（80-20）∶水=97.5∶2.5時，峰的對稱性較差，拖尾較明顯，因此流動相的比例選用乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5。

3.3 流速的選擇

以乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5為流動相，柱溫25℃，檢測波長504 nm，分別設(shè)置流速0.5、0.75、1.0、1.25 mL/min進(jìn)行色譜測定。結(jié)果表明，隨著流速增大，保留時間減小，而且減少的幅度越來越小，在試驗(yàn)過程中，結(jié)合對色譜柱的考慮，選擇了適中流速1.0 mL/min。

3.4 柱溫的選擇

以乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5為流動相，檢測波長504 nm，流速1.0 mL/min，分別設(shè)置柱溫為15、20、25、30、35℃，進(jìn)行色譜測定。結(jié)果表明，柱溫每升高5℃，保留時間減小約1 min左右，且有拖尾出現(xiàn)，對稱性較差，而柱溫15℃時，無拖尾，且峰型較好，對稱性高，因此選擇柱溫為15℃。

因此，選擇色譜條件：流動相為乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5，流速1.0 mL/min，柱溫15℃，檢測波長504 nm下測定蘇丹紅Ⅲ，保留時間在12.8 min，峰寬50.000，峰形對稱，無拖尾。

3.5 結(jié)論

本文利用HPLC-PDA法測定了辣椒制品和雞蛋七種食品中蘇丹紅Ⅲ的微量含量。該方法操作簡便、快速，精密度、穩(wěn)定性良好。在檢測過程中，線性范圍較寬，回收率較好，完全能夠滿足測定要求。通過質(zhì)譜，進(jìn)一步驗(yàn)證了檢測到的4種食品中蘇丹紅Ⅲ的存在，利用質(zhì)譜檢測到蘇丹紅Ⅲ的分子離子峰為m/z 353，主要碎裂成m/z 156和m/z 197。

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Determination of Trace SudanⅢin Foodstuffs by HPLC-PDA

GAO Rui-yuan，WU Le-chen，ZHANG Hai-rong
（Laboratory of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers'College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

A HPLC-PDA method was established for determination of trace SudanⅢin foodstuffs.The chromatographic conditions were：Symmetry C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used with mobile phases composedofacetonitrile-acetone（80-20）：water=95∶5，under the detection wavelength for 504 nm，1.0 mL/min as the flow rate，column temperature 15℃.The peak area and the concentration of SudanⅢshowed a good linear relationship：A=26 310ρ-911.78（ρ：μg/mL），R2=0.999 2，in the range of 0.03 μg/mL-101.86 μg/mL.The above method precision was good and stability was strong.The adding standard recoveries of four kinds of samples were between 97.33%-100.00%，according with the requirement of the determination.HPLC-PDA method was accurate and fast and it could be used for the determination of SudanⅢ.To further validate the existence of SudanⅢin these samples by mass spectrometry.Mass spectrometry showed that SudanⅢmolecular ion peak was m/z 353，main cracked into m/z 156 and m/z 197.

high performance liquid chromatograph；mass spectrometry；SudanⅢ；foodstuffs

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.031

2016-07-26

忻州師范學(xué)院青年基金項(xiàng)目（QN201519）；忻州師范學(xué)院應(yīng)用化學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐基地（2013-31）

高瑞苑（1988—），女（漢），助教，碩士研究生，從事物質(zhì)分離、提取工作。