薛羚偉，胡代玉，張秋月，郝雨婞，孫琴，袁博，蔣繼宏，*

（1.江蘇師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221116；2.山東省東阿縣農(nóng)業(yè)局，山東聊城252200；3.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州221116）

加壓毛細(xì)管電色譜-固相萃取測定鏈格孢霉毒素

薛羚偉1，胡代玉2，張秋月3，郝雨婞3，孫琴3，袁博1，蔣繼宏1，*

（1.江蘇師范大學(xué)江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221116；2.山東省東阿縣農(nóng)業(yè)局，山東聊城252200；3.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州221116）

以霉變柑橘為材料，建立同時檢測鏈格孢酚甲基乙醚（AME）、鏈格孢酚（AOH）和鏈格孢毒素（ALT）3種鏈格孢霉菌毒素的固相萃取-加壓毛細(xì)管電色譜（SPE-pCEC）快速檢測、通過乙腈提取，無水MgSO4和NaCl脫水鹽析，C18SPE萃取凈化，以C18毛細(xì)管色譜柱為分離柱，以含0.1%甲酸的乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，利用熒光檢測器進(jìn)行檢測。該方法在2μg/L～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2≥0.991 5，檢出限為0.1 μg/kg～0.9 μg/kg。結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，適用于食品、水果中常見的3中鏈格孢霉毒素的快速分析及檢測。

加壓毛細(xì)管電色譜；固相萃取；鏈格孢霉毒素

鏈格孢是一類常見的致病性真菌，在自然界中的分布廣泛。它不但能引起多種田間農(nóng)作物病害，給全球的經(jīng)濟(jì)糧食作物造成重大損失，同時還能污染食物和飼料，產(chǎn)生的毒素能導(dǎo)致人和動物中毒[1]。文獻(xiàn)表明，鏈格孢可以產(chǎn)生70多種毒素（以下簡稱鏈格孢霉毒素），包括鏈格孢酚甲基乙醚（AME）、鏈格孢霉素（ALT）、鏈格孢酚（AOH）等[2-3]。這些毒素進(jìn)入人和動物體內(nèi)后，會導(dǎo)致人和動物不同程度的中毒，一些毒性較大的鏈格孢霉毒素還有致癌、致畸和致突變等危害[4-5]。目前，我國現(xiàn)行的食品和飼料標(biāo)準(zhǔn)中尚未有對該類毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)[6]，加之含量較低，我國尚未制定標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，建立快速、靈敏和準(zhǔn)確的鏈格孢霉毒素檢測方法具有重要的意義。

加壓毛細(xì)管電色譜（Pressure Capillary Electrochromatography）是近些年迅速發(fā)展的一種微分離技術(shù)，具有高效、高選擇、高分辨、快速、使用樣品和流動相少等特點(diǎn)。近些年在農(nóng)殘檢測、藥物分析、食品檢測等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[7-10]。

目前，檢測鏈格孢霉毒素的方法主要有高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）、薄層色譜法（TLC）、毛細(xì)管電泳法以及免疫學(xué)檢測法等[11-15]。這些方法大多具有較高的靈敏度和分辨度，具有一定的應(yīng)用前景。但尚未有文獻(xiàn)報(bào)道使用加壓毛細(xì)管電色譜分析鏈格孢霉毒素的文獻(xiàn)，本文使用固相萃取柱對霉變柑橘中的鏈格孢霉毒素進(jìn)行富集，利用加壓毛細(xì)管電色譜這一新興分析技術(shù)對3種常見的鏈格孢霉毒素進(jìn)行分析測定。建立的方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于3種鏈格孢霉毒素的快速分析及檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鏈格孢酚甲基乙醚、鏈格孢霉素、鏈格孢酚標(biāo)準(zhǔn)品：購置于新加坡Pribolab公司和美國Sigma公司；SPE固相萃取柱：購置于天津博納艾杰爾公司；乙腈和甲醇（色譜純）：購置于Fisher公司；甲酸、氯化鈉（分析純）：購置于國藥集團(tuán)；

加壓毛細(xì)管電色譜TriSep-2100（配激光誘導(dǎo)熒光檢測器）、C18毛細(xì)管電色譜柱：上海通微分析技術(shù)有限公司；HS 501振蕩器：德國IKA公司；Mili-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

參照史文景方法[16]，取3種鏈格孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品制備3種鏈格孢霉毒素母液，然后用稀釋法配制0.05 mg/mL～0.25 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-30℃保存。以沒有霉變的柑橘皮和果肉制備基質(zhì)空白溶液，利用基質(zhì)空白溶液稀釋母液到0.05 mg/mL～0.25 mg/mL，得到基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品提取和凈化

柑橘處理：市場購置柑橘60個，其中30個噴灑鏈格孢菌懸浮液后存放于4℃冰箱貯存，待長滿霉菌后用搗碎機(jī)將樣品加工成漿狀，混勻，裝入潔凈的盛樣容器中編號，其余30個直接制樣編號。

取柑橘樣品5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL具塞試管中，加5 mL去離子水、4.0 g氯化鈉和15 mL乙腈，提取60 min，4 500 r/min離心3 min，重復(fù)提取3次，合并上清溶液，過無水Na2SO4脫水后，將其置于40℃下真空濃縮至干，用1 mL甲醇溶解濃縮后得到殘?jiān)? mL水稀釋。將Oasis HLB固相萃取柱用5 mL甲醇和水活化，將提取得到的樣品提取液上樣，用2 mL甲醇-水（2∶8）淋洗，減壓抽干5 min。在NH2固相萃取柱上端裝填約2 cm高的硫酸鈉，用5 mLCH2Cl2淋洗串聯(lián)固相萃取柱，用乙酸乙酯-1%甲酸化的甲醇（1∶1）洗脫，收集洗脫溶液，濃縮至干，并用氮?dú)獯蹈?。用初始流動相定容?.00 mL，過0.22 μm微孔濾膜，待用。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：C18毛細(xì)管色譜柱；流動相體系：0.1%甲酸溶液-乙腈；梯度洗脫，在0～5 min，乙腈由20%線性增至80%，保持2 min，在0.1 min內(nèi)恢復(fù)至20%，保持1 min；進(jìn)樣量3 nL；流速0.05 mL/min；檢測熒光波長：0～3 min激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為323 nm和478 nm，3 min～5 min以后激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為339 nm和404 nm，之后激發(fā)和發(fā)射波長分別為340 nm和408 nm。

利用單因素法對提取時間、溶劑選擇、SPE填料選擇以及洗脫溶液體積以3種鏈格孢毒素標(biāo)準(zhǔn)品回收率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取系統(tǒng)的建立

固相萃取前處理一般采用液液萃取的辦法，為保證提取效果，在樣品中先加入少量水使得樣品分散，然后進(jìn)行萃取，本文考察乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇和乙腈這幾種提取溶液的提取效果，結(jié)果見圖1所示。

圖1 提取溶劑的選擇Fig.1 The selection of extraction solvents

從圖1可以看出，二氯甲烷和丙酮對3種鏈格孢霉毒素的加標(biāo)回收率不到60%，用乙腈和甲醇提取到的回收率較好，但甲醇提取時會融入一部分脂溶性成分（比如色素），在后續(xù)凈化時會增加工作量。乙酸乙酯在提取時溶液較渾濁，而且大部分脂溶性成分也進(jìn)入乙酸乙酯中。此外，甲醇與水可以輕易互溶，會造成水溶性雜質(zhì)被提取出來，不利于后續(xù)的濃縮，在過SPE柱子時也會造成固相萃取柱堵塞，而乙腈在高濃度鹽存在的情況下能夠與水有效分層，避免了粘液質(zhì)和糖類物質(zhì)等水溶性雜質(zhì)的提出，有效減少了色素的提取，對后續(xù)的鹽析、濃縮和凈化都有較好的效果，所以最終選擇乙腈為提取溶劑。

2.2 提取時間的優(yōu)化

本試驗(yàn)以乙腈為提取劑，以振蕩的形式進(jìn)行提取，考察提取時間對于3種鏈格孢霉毒素回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時間對3種毒素回收率的影響（0.1 mg/kg加標(biāo)量）Fig.2 Effect of extraction time on the recoveries of three mycotoxins（at spiked level 0.1 mg/kg）

從圖2可以看出，10 min～30 min內(nèi)，3種鏈格孢霉毒素的回收率增加速度較快，當(dāng)提取時間超過30min過后，3種鏈格孢霉毒素的回收率仍有提高，但提高速度變緩，其中鏈格孢酚甲基乙醚（AME）的變化最為明顯。當(dāng)時間大于40 min后，3種鏈格孢霉毒素的回收率都變化不大，因此本試驗(yàn)將40 min作為提取的最佳時間。

2.3 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱有很多類型，在實(shí)際的萃取中可以選用性質(zhì)不同的固相萃取小柱進(jìn)行測試，本試驗(yàn)考察了Florisil固相萃取小柱和C18、HLB固相萃取柱的凈化效果，通過加標(biāo)回收來對固相萃取小柱進(jìn)行選擇。結(jié)果見圖3所示。

圖3 固相萃取小柱的選擇Fig.3 The selection of solid phase extraction column

通過圖3可以看出，C18柱凈化后3種霉毒素除了AME之外，其余兩種霉毒素回收率均不到50%，F(xiàn)lorisil柱凈化后，AOH和ALT回收率較高，但AME回收率不高，然而HLB固相萃取柱凈化后，3種霉毒素回收率均達(dá)到96%以上，因此可以選擇HLB固相萃取柱作為凈化柱使用。

2.4 洗脫溶劑的優(yōu)化

確定固相萃取體系后，對洗脫液[乙酸乙酯-1%甲酸化的甲醇（1∶1）]體積的選用進(jìn)行了優(yōu)化。固相萃取柱上樣后用不同體積的洗脫溶劑淋洗，用標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)回收法進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 洗脫溶劑體積的選擇Fig.4 The selection of solvent elution volume

從圖4可以看出，隨著洗脫溶劑體積的不斷加大，3種毒素的回收率也是逐漸增加的，使用8 mL時毒素的回收率已經(jīng)到達(dá)最大，因此洗脫體積選擇8 mL為適宜體積。

2.5 方法的評價(jià)

2.5.1 線性關(guān)系和檢出限

利用pCEC測定復(fù)雜基質(zhì)樣品時，基質(zhì)效應(yīng)會干擾樣品分析的準(zhǔn)確性，很容易降低方法的靈敏度[6，16]。基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使得標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的吸收條件相同，這樣可以減弱基質(zhì)效應(yīng)，因此本試驗(yàn)采用基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 3種霉毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1 Liner ranges，linear equations，correlation coefficients and limits of detection（LODs）for three patulin

如表1所示，3種鏈格孢霉毒素在2 μg/L～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)都大于0.991 5，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算，3種鏈格孢霉素的檢出限均低在0.2 μg/kg～0.9 μg/kg之間。

2.5.2 加標(biāo)回收率和精密度

制備果皮和全果樣品，添加10、50、100 μg/kg 3個水平的3種霉毒素，每個添加水平重復(fù)測定5次，結(jié)果見表2。

表2 柑橘果皮、全果3種霉毒素的添加回收率和精密度（n=5）Table 2 Recovery rates and precision for three patulin in citrus peel and whole fruits（n=5）

如表2所示，3種毒素物質(zhì)在3個加標(biāo)水平的平均回收率為81.3%～103.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%～9.7%，具有較高的回收率和精密度，表明該方法適用于3種毒素的檢測。

2.5.3 實(shí)際樣品測定

從市場上隨機(jī)抽取50個柑橘樣本，按方法準(zhǔn)備果皮、全果樣品，先使用免疫法進(jìn)行篩選，然后用SPE－pCEC法分析測定。

首先將3個對照品進(jìn)行混標(biāo)處理，繼而對混標(biāo)樣品進(jìn)行pCEC分析，同時對樣品進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5所示。

從圖5可知，3種鏈格孢毒素的分離度良好，能很好分離開3種毒素，且在10 min內(nèi)完成分析。樣品譜圖中3種毒素保留時間與混標(biāo)樣品基本一致，且各組分分離度良好。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行3種鏈格孢毒素含量的定量計(jì)算，結(jié)果列于表3。

圖5 3種鏈格孢毒素以及樣本的pCEC譜圖Fig.5 The pCEC spectrograms of three kinds of A.alternata toxin and sample

表3 利用SPE-pCEC檢測鏈格孢毒素的含量Table 3 The contents of three patulin by the SPE-pCEC

由表3可知，21份果皮樣本呈陽性，對這21份樣本測定，3種鏈格孢霉毒素含量在1.4 μg/kg～27.2 μg/kg之間，10份全果樣本呈陽性，但只檢出AME和AOH，含量分別為2.4 μg/kg～6.7 μg/kg和3.2 μg/kg～8.4 μg/kg。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了SPE－pCEC檢測3種常見的鏈格孢霉毒素，利用SPE方法優(yōu)化了提取和凈化條件。利用pCEC檢測方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確、檢出限低、重現(xiàn)性好，能夠在10 min內(nèi)完成檢測。利用該方法隨機(jī)檢測水果中3種鏈格孢霉毒素，能很好地測定出樣本中的毒素含量，通過本研究，證明SPE－pCEC方法適用于對鏈格孢霉毒素的快速以及含量監(jiān)控。

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Simultaneous Determination of Alternaria mycotoxins in Food by Pressure Capillary Electrochromatography Combined with SPE

XUE Ling-wei1，HU Dai-yu2，ZHANG Qiu-yue3，HAO Yu-xing3，SUN Qin3，YUAN Bo1，JIANG Ji-hong1，*
（1.Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，Jiangsu，China；2.Dong'e Agriculture Bureau，Liaocheng 252200，Shandong，China；3.School of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，Jiangsu，China）

A method was developed for simultaneous determination of three mycotoxins（AME，AOH and ALT）with SPE-pCEC using the material of moldy citrus.After being extracted by acetonitrile，salted-out dehydration by anhydrous MgSO4and NaCl，purified by C18SPE extraction，the test samples were gradient elution of acetonitrile with containing 0.1%formic acid as mobile phase and separating column with C18capillary as chromatographic column，using fluorescence detector for testing.The linearity of this method in the range of 2 μg-200 μg/L is good.The r2correlation coefficient was over 0.991 5.The detection limit was 0.1 μg/kg-0.9 μg/kg. Results showed that this method was rapid，accurate，sensitive and suitable for the fast detection of the three kinds of common alternaria mycotoxins comes from food and fruit.

pressurized capillary electrochromatography；solid phase extraction；Alternaria mycotoxins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.022

2016－08－04

國家自然基金項(xiàng)目（31170605，31370646）；江蘇師范大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510320103X，201603017，201603018）

薛羚偉（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：藥食植物分析檢測。

*通信作者：蔣繼宏（1962—），男（漢），教授，博士。