唐永華，程建兵

(1、深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳518106；2、杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州310023)

一種制作骨髓染色體G帶的改良方法

唐永華1，程建兵2

(1、深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳518106；2、杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州310023)

目的建立一種具有分裂相多、分散度好、帶紋清晰、長度適中等特征的骨髓染色體G帶制作方法。方法在含9. 6%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中加入一定量的人淋巴瘤細(xì)胞系培養(yǎng)物，接種骨髓細(xì)胞后培養(yǎng)24h，然后加入終濃度為30μg/ml的溴化乙錠和0.06μg/ml的秋水仙胺作用1h。結(jié)果通過方法改良，骨髓標(biāo)本培養(yǎng)成功率約為傳統(tǒng)方法的1.59倍，異常染色體檢出率比傳統(tǒng)方法提高了51%。結(jié)論改良后的方法可以制作出個(gè)數(shù)更多、分散度更加良好、帶紋更加清晰、染色體更長的中期分裂相，因而異常染色體檢出率更高，診斷結(jié)果更加可靠。

骨髓染色體；G帶；溴化乙錠

近年來，隨著分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展，骨髓染色體核型分析在血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療和預(yù)后中發(fā)揮了越來越重要的作用。由于骨髓中含有大量的脂肪顆粒，且各種細(xì)胞系的細(xì)胞周期不固定，不統(tǒng)一，因而傳統(tǒng)培養(yǎng)骨髓的方法（在含一定量胎牛血清的RPMI1640中接種骨髓細(xì)胞培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前加入一定量的秋水仙素）制備出的染色體G帶往往出現(xiàn)染色體分裂指數(shù)低，染色體短粗，分散度差等缺點(diǎn)，從而導(dǎo)致可分析的分裂相少，異常檢出率低，診斷結(jié)果不可靠。因此，建立一種具有分裂相多、分散度好、帶紋清晰、長度適中等特征的骨髓G帶制作方法尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源隨機(jī)選取2000例來自全國各地多加醫(yī)院(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院400例、臺(tái)州醫(yī)學(xué)院300例、德陽市人民醫(yī)院300例、三明市第一醫(yī)院200例、武漢市第一醫(yī)院400例、安徽省第二人民醫(yī)院400例)的骨髓標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。骨髓標(biāo)本要求使用專用肝素鈉抗凝管，無溶血、無凝血、未經(jīng)過高溫和冷凍且無污染的合格標(biāo)本。

1.1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、溴化乙錠、秋水仙胺、胰酶、Giemsa染液均購自Sigma公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，青霉素和鏈霉素的混合物購自Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 改良骨髓培養(yǎng)基配制

1.2.1.1 人淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的制取利用含9.6% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)人淋巴瘤細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大約50%融合率時(shí)，更換培養(yǎng)基，至終濃度40ml左右。當(dāng)培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時(shí)準(zhǔn)備收集。用血清移液管將培養(yǎng)好的細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml圓底聚丙乙烯離心管中，2000r/min離心10min。收集上清液，并經(jīng)0.22μm無菌濾器過濾，即為人淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物[1]。

1.2.1.2 骨髓培養(yǎng)基配方見表1。

表1 骨髓培養(yǎng)基配方

表2 超過20個(gè)良好分裂相的病例數(shù)比較結(jié)果

1.2.2 培養(yǎng)、收獲及染色標(biāo)本接種后37℃，5%CO2培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前1h加入50μl濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25μl濃度為12μg/ml的秋水仙胺。離心后收集細(xì)胞，加入8ml 0.075M KCl 37℃水浴箱低滲15min。預(yù)固定后，吸取上清液，將沉淀渦旋混勻后加入8ml新鮮固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），室溫靜置30min。重復(fù)固定3次后將懸液調(diào)整為適宜濃度，滴片后放入80℃烤箱1h，室溫放置一段時(shí)間后進(jìn)行常規(guī)Giemsa染色[2～6]。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在染色體分裂相個(gè)數(shù)和分散度方面的比較

圖2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在染色體長度方面的比較

2 結(jié)果

2.1 骨髓培養(yǎng)成功率對(duì)比實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各做兩張G帶片，同一樣本由同一人觀察計(jì)數(shù)良好分裂相個(gè)數(shù)（即帶紋清晰可辨、染色體個(gè)數(shù)齊全且比較分散而不影響診斷）。良好分裂相個(gè)數(shù)≥20個(gè)，認(rèn)為此骨髓標(biāo)本培養(yǎng)成功[7，8]。如表2和圖1所示結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組鏡下（采用OLYMPUS顯微鏡，型號(hào)BX43，JVC彩色攝像機(jī)型號(hào)TK-C9201EC）觀察能達(dá)到20個(gè)以上良好分裂相的樣本數(shù)均高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的1.59倍，且無論在何種疾病檢測(cè)中骨髓培養(yǎng)成功率均好于對(duì)照組。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P=0.026，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 帶紋及染色體長度對(duì)比實(shí)驗(yàn)由于8號(hào)染色體變異較小，長度適中，因而利用Leica自動(dòng)掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)分別對(duì)同一標(biāo)本兩種不同方法所得的8號(hào)染色體進(jìn)行相對(duì)長度的測(cè)量。常規(guī)方法8號(hào)染色體平均長度為34.12mm，改良方法8號(hào)染色體平均長度為46.33mm，兩者存在明顯差異[9]。如圖2所示鏡檢結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中染色體帶紋更加清晰可辨，且染色體更長，更有利于異常染色體的檢出。

2.3 異常染色體檢出對(duì)比實(shí)驗(yàn)應(yīng)用G顯帶技術(shù)進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)（CC）核型分析，核型異常按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN2009）》進(jìn)行描述。至少2個(gè)細(xì)胞有同樣的染色體增加或結(jié)構(gòu)重排，或者3個(gè)細(xì)胞有同樣的染色體丟失，方可確認(rèn)為一個(gè)異?？寺10-16]。將以上病人的染色體核型分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)組異常染色體例數(shù)為1741，對(duì)照組異常染色體例數(shù)為1154例，如表3所示結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組異常核型檢出率約為對(duì)照組的1.51倍，且無論在何種疾病的檢測(cè)中，均高于對(duì)照組。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P=0.004，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 染色體異常檢出率的比較

3 討論

骨髓染色體核型分析在惡性血液病的診斷、治療及預(yù)后方面發(fā)揮著重要的作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有80%～85%的白血病患者存在染色體核型異常。染色體異常的檢出不僅靠檢驗(yàn)技術(shù)人員的豐富經(jīng)驗(yàn)，而且與骨髓染色體標(biāo)本制備技術(shù)有著直接的關(guān)系。標(biāo)本制備得好可以獲得數(shù)量多和質(zhì)量好的染色體中期分裂相，有利于技術(shù)人員分析并提高染色體異常檢出率。

傳統(tǒng)的骨髓染色體培養(yǎng)無非是在含一定量胎牛血清的RPMI1640中接入一定量的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)24h，然后通過秋水仙素濃度、作用時(shí)間、低滲時(shí)間等因素的優(yōu)化以達(dá)到獲得較多良好分裂相的目的。而本實(shí)驗(yàn)室在長期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了獲得良好的中期分裂相，主要做了以下改進(jìn)：⑴在常規(guī)骨髓培養(yǎng)基中加入了人淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物。由于人淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物能分泌促增殖作用的生長因子并提供了其它營養(yǎng)物質(zhì)，因而骨髓細(xì)胞培養(yǎng)后分裂相形態(tài)更加良好，數(shù)量也有所增加[1]。⑵終止培養(yǎng)時(shí)使用了溴化乙錠和秋水仙胺。溴化乙錠是一種菲錠類染料，可以無選擇地嵌入DNA和RNA中，使染色體帶紋更為清淅。另一方面，它是一種染色體收縮抑制劑，可阻止染色體的完全螺旋化和收縮變短而使染色體伸長。此外，秋水仙胺是秋水仙素的衍生物，毒性比秋水仙素更小，減少了對(duì)骨髓細(xì)胞的損害。因而，獲得的中期分裂相更多、分散度更好、長度更長且?guī)Ъy更加清晰。由于制取的G帶穩(wěn)定性更好，因而使用不同的顯微鏡均能觀查到良好的分裂相，異常染色體檢出率更高，診斷結(jié)果更加可靠。對(duì)各種不同的疾病患者的骨髓染色體進(jìn)行染色，效果均優(yōu)于現(xiàn)有方法。利于預(yù)后危險(xiǎn)程度劃分，在白血病診斷、治療及預(yù)后判斷中具有重要的臨床意義。與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)過程中我們也發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后的方法在培養(yǎng)淋巴瘤疾病的骨髓細(xì)胞方面效果并不明顯，培養(yǎng)成功率及染色體異常檢出率仍然較低。在后續(xù)檢測(cè)過程中，需要進(jìn)一步的研究總結(jié)。

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The improved technique of bone marrow chromosome G-banding

TANG Yonghua1，CHENG Jianbing2.1.Shenzhen Guangming New District People’s Hospital，Shenzhen Guangdong 518106，China；Hangzhou Adicon Clinical Laboratories，INC，Hangzhou Zhejiang 310023，China.

Objective To build a method for bone marrow chromosome G-banding with more and better metaphase chromosomes.Methods Some culture from human lymphocyte carcinoma cell line was added into the traditional bone marrow medium，then the marrow cells were cultured about 24h.At the second day，30μg/ml ethidium bromide and 0.06μg/ml colcemid at the final concentration were added into the above medium and incubated about 1h prior to cell harvest.Results The rate of successful chromosome preparation were about 1.59 times the rate of control and the detection rate of chromosome aberrations were improved 51%.Conclusion By the improved methods，better metaphase chromosomes could be obtained to be analyzed easily，so the diagnosis would be more exactly.

Bone marrow chromosome；G-banding；Ethidium bromide

R446.8

A

1674-1129(2017)02-0193-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.017

2016-07-05；

2017-02-15)

唐永華，男，1977年生，主管檢驗(yàn)師，主要從事醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，Email：tyh1024@sina.com

程建兵，男，1982年生，碩士學(xué)位，檢驗(yàn)技師，主要從事惡性血液病的研究，Email：chengjianbing2979@163.com