汪小磊，王紅寧，鄭慶紋，易維維

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都 610023

乙型腦炎減毒活疫苗工藝中金黃地鼠腎細胞培養(yǎng)液里谷氨酰胺添加的研究

汪小磊1，王紅寧1，鄭慶紋2，易維維2

1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川成都 610023

目的 比較谷氨酰胺在不同濃度和不同添加階段的條件下，作為細胞生長液的成分，對乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)中金黃地鼠腎細胞的培養(yǎng)效果以及后續(xù)生產(chǎn)工藝的影響。方法①以兩種添加階段：將谷氨酰胺作為細胞生長液體培養(yǎng)基的成分加入細胞培養(yǎng)和培養(yǎng)細胞時臨時配制后加入細胞培養(yǎng)；②以不同的濃度：按0.05、0.1、0.2 g/L的濃度加入細胞培養(yǎng)。結(jié)合兩種條件后，每種組合條件生產(chǎn)3批地鼠腎細胞，對所有批次細胞的生長情況及后續(xù)接種病毒后，對應(yīng)的病毒生長情況進行比較研究。 結(jié)果 谷氨酰胺在培養(yǎng)細胞時臨時配制后加入細胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細胞質(zhì)量優(yōu)于其作為細胞生長液體培養(yǎng)基的成分加入細胞培養(yǎng)，采用秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002＜0.05）；谷氨酰胺按0.1 g/L和0.2 g/L的濃度加入細胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細胞質(zhì)量優(yōu)于按0.05g/L濃度，在2種添加階段其，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02＜0.05），但0.1g/L和0.2 g/L的濃度之間，無論谷氨酰胺的添加階段在培養(yǎng)基中添加P=0.513，在培養(yǎng)時臨時添加P=0.827），兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論 在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)所需的地鼠腎細胞培養(yǎng)中，谷氨酰胺適合在培養(yǎng)細胞時臨時配制后加入細胞培養(yǎng)容器，濃度不宜低于0.1g/L。

乙型腦炎減毒活疫苗；谷氨酰胺；地鼠腎細胞培養(yǎng)；添加階段；濃度

谷氨酰胺，學(xué)名2-氨基-4-氨甲?；∷?，英文Glutamine(Gln)，是細胞生長中蛋白質(zhì)合成必需的編碼氨基酸，除了在人體內(nèi)代謝和免疫中的作用外，國內(nèi)外文獻對其在動物基質(zhì)培養(yǎng)基中的作用做了明確闡述，可以作為培養(yǎng)基必需的氮源并促進細胞生長和分化。在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)過程中，用于繁殖乙腦病毒的金黃地鼠腎細胞是貼壁培養(yǎng)的原代動物細胞，該細胞的生長液主要包括通過Medium199（Earle’s）改良后的109液和新生牛血清，谷氨酰胺作為生長液的重要成分。目前谷氨酰胺可以作為細胞生長液體培養(yǎng)基的成分參與細胞培養(yǎng)，或在培養(yǎng)細胞時臨時單獨配制后參與細胞培養(yǎng)，其添加的階段和濃度對地鼠腎細胞質(zhì)量和后續(xù)的病毒質(zhì)量指標有顯著影響，因此該研究通過不同濃度及添加階段的條件下加入谷氨酰胺進行試生產(chǎn)，對谷氨酰胺在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)中的使用方法進行比較研究，期望通過試驗得到其在乙型腦炎減毒活疫苗生產(chǎn)中較好的使用方法，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 金黃地鼠 選用同一飼養(yǎng)單元的SPF級金黃地鼠360只，按完全相同的操作步驟進行地鼠處死、腎塊采集和剪碎。

1.1.2 地鼠腎細胞 剪碎的地鼠腎在三角瓶內(nèi)經(jīng)1%胰蛋白酶液在低溫消化20 h后分裝成18批地鼠腎細胞。

1.1.3 新生牛血清 市售Hyclone藥用級新生牛血清。

1.1.4 109液 通過Medium199（Earle’s）改良后的109液，以Earle’s液為平衡溶劑包含多種氨基酸和乳蛋白等成分[1]。在其他成分相同的情況下，分別制備谷氨酰胺濃度為0.062 5、0.125、0.25 g/L以及不含谷氨酰胺共4種規(guī)格溶液，除菌過濾后儲存于2～8℃，儲存時間持續(xù)一周[2]。

1.1.5 乙型腦炎減毒株病毒 SA14-14-2批工作種子批毒種

1.1.6 病毒維持液市售Gibco MEM液體培養(yǎng)基

1.1.7 谷氨酰胺 市售國藥集團化學(xué)試劑有限公司

1.2 方法

使用Earle’s液將18批地鼠腎細胞容器內(nèi)的胰蛋白酶液沖洗干凈，按每組3批分為6組（A～F，組內(nèi)編號1～3），用于谷氨酰胺不同的使用條件。A1組操作如下：在A級層流環(huán)境下，將含谷氨酰胺的109液2 000 mL，其中谷氨酰胺含量為0.0 625 g/L，新生牛血清150 mL加入15 L玻璃瓶中，經(jīng)少量碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至7.5[3]，加入Earle’s液定容至2 500 mL制成細胞生長液，該生長液中谷氨酰胺終濃度為0.05 g/L[4]。在其中加入一批地鼠腎細胞，經(jīng)45～50℃水浴2 min后，水平放置于轉(zhuǎn)瓶機上，在36～38℃下，以3～6 r/h培養(yǎng)70 h。

以同樣的方法對B～F組進行操作，區(qū)別為各組使用的109液和谷氨酰胺含量不同。各組的谷氨酰胺添加條件分別為：A以109液成分加入，濃度為0.05 g/L；B以109液成分加入，濃度為0.1 g/L；C以109液成分加入，濃度為0.2 g/L；D臨時配制后加入，濃度為0.05 g/L；E臨時配制后加入，濃度為0.1 g/L；F臨時配制后加入，濃度為0.2 g/L。

1.2.1 細胞生長情況的觀察 生產(chǎn)中期望地鼠腎細胞貼壁生長，在顯微鏡下輪廓清晰，形態(tài)飽滿且整體呈現(xiàn)為致密的單層，通過鏡檢視野內(nèi)細胞的分布情況將致密度分為50%～75%、75%～90%以及90%以上3檔。

1.2.2 病毒生長情況的判定 將培養(yǎng)后的18批細胞瓶內(nèi)的細胞生長液移除，分別接種乙型腦炎減毒株病毒，加入病毒維持液2 000 mL后置于35～37℃下，以3～6 r/h培養(yǎng)50 h。培養(yǎng)結(jié)束后采集各瓶樣品運用噬斑法進行病毒滴定檢測[7]。

2 結(jié)果

2.1 不同時間、不同濃度添加谷氨酰胺后細胞生長情況對比

通過細胞培養(yǎng)后的鏡檢可見，谷氨酰胺在制備109液時加入，經(jīng)2～8℃儲存一周后進入細胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細胞質(zhì)量低于培養(yǎng)細胞時臨時配制谷氨酰胺加入生長液。另外以0.05 g/L濃度添加谷氨酰胺會顯著降低細胞質(zhì)量，見表1。

2.2 不同時間、不同濃度添加谷氨酰胺后病毒滴度比較

通過病毒滴定實驗的檢測可見，谷氨酰胺在制備109液時加入，經(jīng)2～8℃儲存一周后進入細胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細胞接種病毒后，病毒生長情況較差，病毒滴度低于臨時配制谷氨酰胺加入培養(yǎng)的情況。另外以0.05 g/L濃度添加谷氨酰胺在降低細胞質(zhì)量的同時，也影響了后續(xù)接種病毒后病毒的生長，見表2。

表2 不同時間、不同濃度添加谷氨酰胺后病毒滴度比較（logPFU/mL）

由于乙型腦炎減毒活疫苗病毒滴度是非正態(tài)數(shù)據(jù)，因此采用秩和檢驗（Mann-Whitney U）對以上數(shù)據(jù)進行分析。①D、E、F組為臨時配制谷氨酰胺加入培養(yǎng)，滴度值與A、B、C 3組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.002＜0.05）；②B、C組和E、F組在谷氨酰胺添加階段一致的條件下，B、C組滴度高于A組（P=0.02＜0.05），同樣的E、F組滴度高于D組（P=0.02＜0.05）；③B、E組谷氨酰胺濃度為0.1g/L，C、F組谷氨酰胺濃度為0.2 g/L，在谷氨酰胺添加階段一致的條件下，B和C的滴度差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.513＞0.05），E和F的滴度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.827＞0.05）。

3 討論

在乙型腦炎減毒活疫苗的生產(chǎn)流程中，根據(jù)谷氨酰胺在不同階段添加和以不同濃度添加兩種條件進行試生產(chǎn)后，對所有批次細胞的生長情況及后續(xù)接種病毒后對應(yīng)的病毒生長情況進行比較。在此項比較性研究中可見，谷氨酰胺在培養(yǎng)地鼠腎細胞時臨時配制后加入細胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細胞質(zhì)量優(yōu)于其作為液體培養(yǎng)基的成分經(jīng)儲存后加入細胞培養(yǎng)，谷氨酰胺按0.1 g/L和0.2 g/L的濃度加入細胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的地鼠腎細胞質(zhì)量優(yōu)于按0.05 g/L濃度。分析原因為谷氨酰胺是一種較不穩(wěn)定的氨基酸，隨著時間的推移，會轉(zhuǎn)換成細胞不能利用的形態(tài)[5-6]，雖然眾多知名進口品牌市售含谷氨酰胺的培養(yǎng)基儲存條件為2～8℃，有效期常為數(shù)月，但通過試驗可見在乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)中的地鼠腎細胞培養(yǎng)時，使用谷氨酰胺適宜在培養(yǎng)時臨時配制后添加，這樣能夠更好保持其有效成分幫助細胞生長。另外由于谷氨酰胺是一種條件必需性氨基酸，既是氮源又有組織生長和修補作用[8-9]，在乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)中，細胞生長液的谷氨酰胺濃度不宜低于0.1 g/L。傳統(tǒng)的哺乳動物細胞培養(yǎng)基Medium199中谷氨酰胺含量即為0.68 mmol/L（約0.099 g/L）[10]，同時考慮到測試結(jié)果顯示繼續(xù)提升谷氨酰胺濃度沒有顯著提升細胞質(zhì)量，且過多的谷氨酰胺可能會降解導(dǎo)致對細胞有害的氨生成，因此在乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)階段繼續(xù)提升谷氨酰胺濃度需要謹慎試驗并進行更多觀察和研究。

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R521.6

A

1672-5654（2017）02（c）-0043-03

2016-11-24）

汪小磊（1985.12-），男，四川成都人，本科，醫(yī)學(xué)生物工程系列工程師，研究方向：生物工程專業(yè)（動物細胞培養(yǎng)）。

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.06.043