喬明鋒，劉陽，袁小鈞，易宇文，彭毅秦，鄧靜

（1.四川旅游學(xué)院，成都，610100；2.中國科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點實驗室，生態(tài)恢復(fù)與生物多樣性保育四川省重點實驗室，中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041）

茂縣花椒化學(xué)成分分析及抑菌活性研究

喬明鋒1，2，劉陽1＊，袁小鈞1，易宇文1，彭毅秦1，鄧靜1

（1.四川旅游學(xué)院，成都，610100；2.中國科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點實驗室，生態(tài)恢復(fù)與生物多樣性保育四川省重點實驗室，中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041）

綜合運用多種化學(xué)分析方法對茂縣花椒化學(xué)成分進行深入研究，并探索其抑菌活性，結(jié)果表明：樣品水分含量9.5%，總灰分含量5.5%，總碳含量44.14%，總氮含量2.23%，碳氮比19.79，銨態(tài)氮含量13.56mg／kg，蛋白質(zhì)含量9.72g／100g；經(jīng)氨基酸自動分析儀檢測其含有17種氨基酸，總量達到7.15%；經(jīng)紅外光譜、電子鼻和GC－MS定性與定量分析，其揮發(fā)性成分主要包含酯類、醛類、烯類、醇類、酮類等。抑菌活性研究表明：其對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等陽性菌具有明顯的抑制作用，對大腸桿菌和乙型副傷寒沙門氏菌等陰性菌的抑菌活性不明顯。研究較全面地分析了茂縣花椒的化學(xué)基礎(chǔ)和生物活性，為其進一步開發(fā)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

茂縣花椒；化學(xué)成分；揮發(fā)性成分；抑菌活性

花椒，蕓香科花椒屬（ZanthoxylumL.）的一種辛香植物，是我國傳統(tǒng)的八大調(diào)味品之一，其具有賦香、掩蓋異味、著色、保健、增加食欲等作用［1－3］。近年來，隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，花椒的栽植面積不斷擴大，其在四川、陜西、云南、河南等省均有栽植［4，5］。茂縣地處川西青藏高原東緣，為少數(shù)民族聚居地區(qū)，海拔較高，光照充足，晝夜溫差大，環(huán)境污染少，其“大紅袍”花椒栽培歷史悠久，果實以油重粒大、色澤紅亮、芳香濃郁及醇麻可口的獨特風(fēng)味著稱，在市場上享有較高聲譽［6］，因此，對茂縣花椒進行系統(tǒng)的化學(xué)成分和生物活性研究顯得十分必要。

花椒中含有豐富的化學(xué)物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)和烹飪價值。目前，已有許多關(guān)于花椒的研究報道，但對四川茂縣花椒的系統(tǒng)研究相對較少。花椒中的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、黃酮類物質(zhì)和脂肪酸等［7，8］；其中花椒的香氣成分主要來自于其組織中所含的揮發(fā)油，揮發(fā)油是由烯烴類等有機化合物及其含氧衍生物醇、醛、酮、酯等成分組成［9，10］，并且部分化學(xué)物質(zhì)具有較好的生物活性，如抑菌活性等［11－13］。另外，由于花椒品種和生長環(huán)境的不同，其化學(xué)組成與含量差異也很大，造成其品質(zhì)、色澤、香氣及活性強度等發(fā)生較大變化，從而影響其價格和銷量。

本文結(jié)合理化分析，綜合運用總有機碳總氮分析儀、凱氏定氮儀、氨基酸自動分析儀、傅里葉變換紅外光譜儀、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、氣味指紋分析儀（電子鼻）等多種精密儀器對四川茂縣大紅袍花椒化學(xué)成分進行深入分析，并對其抑菌學(xué)活性進行探究，以期為茂縣花椒的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

大紅袍花椒，四川省茂縣本地農(nóng)戶家購得。

1.1.2 儀器設(shè)備

BT423S電子天平 德國賽多利斯公司；FW－100高速萬能粉碎機 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；MB25水分測定儀 上海奧豪斯儀器有限公司；Milti N／C 2100S總有機碳總氮分析儀 德國耶拿分析儀器股份公司；Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀 珀金埃爾默儀器有限公司；紫外可見分光光度計 美國Per－kin Elmer公司；Kjeltec 2200凱氏定氮儀 瑞典FOSS公司；RE－52CS－1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；L－8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司；50／30μm DVB／AR／PDMS萃取頭，Agilent 6890－5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；FOX 4000氣味指紋分析儀 法國Alpha－Mos公司；LS－50GH高壓蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；JJ－CJ－2FD超凈工作臺 金凈凈化設(shè)備科技有限公司。

1.1.3 主要試劑

硫酸銅、酒石酸鉀鈉、苯酚、次氯酸鈉、硫酸鉀、硫酸、硫酸銨、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑、氫氧化鈉、無水乙醇、鹽酸、茚三酮、17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1 水分、灰分測定

將干花椒打粉，采用水分測定儀分別測定3次，結(jié)果取平均值；灰分按照GB／T 12729.7－2008的方法檢測。

1.2.2 銨態(tài)氮、總有機碳、總氮測定

采用靛酚藍比色法測定花椒的銨態(tài)氮含量，總有機碳總氮分析儀測定花椒的總有機碳和總氮，并根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算碳氮比。

1.2.3 蛋白質(zhì)、氨基酸測定

蛋白質(zhì)采取凱氏定氮法測定；氨基酸采用氨基酸自動分析儀測定［14］。

1.2.4 花椒的紅外檢測

將花椒待測樣品在70℃干燥箱中烘烤1h左右至恒重去除水分后，將其粉碎過篩為80目的粉末，將待測花椒樣品采用壓片法分別進行紅外測定，掃描范圍為400～4000cm－1，分辨率為4cm－1，掃描次數(shù)為4次。

1.2.5 揮發(fā)性成分檢測

1.2.5.1 電子鼻檢測

將花椒樣品稱取1g置于頂空瓶中，壓蓋密封，加熱10min后取1000μL氣體使用FOX 4000電子鼻進行分析，進樣速度1000μL／s。在檢測樣品時傳感器的采集時間為120s；在進行數(shù)據(jù)分析與處理時選擇每個傳感器的最大響應(yīng)強度值進行分析，電子鼻傳感器性能見表1。

表1 FOX 4000電子鼻傳感器性能Table 1 FOX 4000electronic nose sensor property

1.2.5.2 GC－MS檢測

頂空固相微萃取條件：準(zhǔn)確量取7mL花椒粉的二氯甲烷浸提液于15mL頂空瓶中恒溫（65℃）水浴，將50／30μm DVB／CAR／PDMS萃取頭插入頂空瓶中平衡10min后吸附30min（在固相微萃取裝置上實現(xiàn)）后，將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸5min，進行GC－MS分析。

色譜條件：毛細(xì)管色譜柱Agilent HP－INNOWax（60m×250μm，0.25μm）；手動無分流進樣，進樣口溫度230℃；程序升溫45℃，保留3min，以10℃／min的速率升至200℃，保留5min；檢測器溫度230℃；載氣He，流速1mL／min。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70eV，掃描范圍10～550μm，離子源溫度230℃；接口溫度230℃。

1.2.6 抑菌活性檢測

將花椒的水提液和醇提液分別對常見的4株細(xì)菌，包括大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B）進行抑菌活性檢測。

指示菌懸液的制備：將大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門氏菌分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃，140r／min培養(yǎng)18h，吸取1mL進行系列梯度稀釋至10－3，儲存于冰箱備用。

抑菌檢測平板的制備：在無菌的牛肉膏蛋白胨固體平板上加0.1mL指示菌懸液，用涂布棒涂抹均勻，放置30min后，于平板內(nèi)均勻放置3個無菌牛津杯，其中一個加入0.1mL無菌水作為空白對照，另兩個牛津杯中分別添加0.1mL花椒水提液和醇提液，37℃條件下培養(yǎng)24h，直尺測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)

實驗測得茂縣大紅袍花椒的水分、灰分、總碳、總氮、銨態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量見表2。

表2 茂縣花椒理化指標(biāo)Table 2 The physical and chemical indexes of Zanthoxylumin Maoxian

由表2可知，樣品水分含量為9.5%，總灰分含量為5.5%，達到國家規(guī)定的一級標(biāo)準(zhǔn)要求；總碳含量44.14%，總氮含量2.23%，碳氮比達到19.79，說明花椒的化學(xué)成分中，含碳物質(zhì)含量較大，其主要為粗纖維中的纖維素和木素；銨態(tài)氮含量13.56mg／kg，粗蛋白含量9.72g／100g，可見其除了含有諸多揮發(fā)油成分之外，還含有豐富的營養(yǎng)成分。

2.2 氨基酸

樣品17種氨基酸含量測定結(jié)果見表3。

表3 氨基酸含量測定結(jié)果Table 3 Results of the amino acid content %

由表3可知，花椒的氨基酸總量較高，達到7.15%；其中含量最高的氨基酸為脯氨酸，其含量為1.10%，最低的是半胱氨酸為0.10%；此外，除色氨酸外，其余7種必需氨基酸總量為2.38%，占氨基酸總量的1／3，說明花椒營養(yǎng)成分豐富，有利于滿足人們健康要求。

2.3 紅外分析

采用溴化鉀混合壓片法，對花椒樣品進行掃描，其紅外光譜圖見圖1。

圖1 茂縣花椒紅外光譜圖Fig.1 The infrared spectrum of Zanthoxylumin Maoxian

由圖1可知，花椒的紅外光譜具有12個明顯的吸收峰，其波數(shù)分別為3383.50，2928.40，1734.22，1623.07，1555.22，1437.13，1369.34，1259.57，1158.89，1066.64，831.47，767.27cm－1，其中3300cm－1附近為醇、酚等有機物的O－H基的伸縮振動；2926＋5cm－1為亞甲基的反對稱振動；1730cm－1為C＝O鍵的伸縮振動；1690～1650，1550，1400cm－1分別為酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶的特征吸收峰；1371cm－1為甲基C－H的對稱彎曲振動；1300～1150cm－1為酯C－O－C的伸縮振動；1019cm－1為醚的C－O鍵的伸縮振動；916cm－1為烯烴RCH＝CH2順構(gòu)型的特征吸收；770cm－1為芳烴孤立氫的特征吸收［15］，說明樣品含有以上相關(guān)功能基團及對應(yīng)的物質(zhì)成分。另外，酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶的吸收峰是蛋白質(zhì)和酰胺類物質(zhì)的特征吸收峰，進一步表明茂縣花椒營養(yǎng)豐富、麻味顯著。

2.4 揮發(fā)性成分

2.4.1 電子鼻檢測分析

采用電子鼻檢測茂縣花椒的揮發(fā)性成分，得到花椒樣品在不同傳感器下的響應(yīng)情況，見圖2。

圖2 花椒樣品在不同傳感器下的響應(yīng)情況Fig.2 The response of Zanthoxylumunder different sensors

為了更直觀地將花椒樣品的信號強度進行對比分析，將電子鼻的18根不同傳感器下的響應(yīng)強度峰值平均分布在圓周上，并描點成一個雷達指紋圖譜，見圖3。

圖3 花椒樣品的雷達指紋圖譜Fig.3 The radar fingerprint of Zanthoxylum

由圖3可知，樣品在不同傳感器下的傳感器信號強度存在顯著差異，其傳感器信號強度較高的主要集中于6種傳感器上，分別為LY／LG，LY2／G，P40／2，P30／1，PA／2，T30／1傳感器，由此可知，花椒的揮發(fā)性成分可能含有胺類化合物、碳氧化合物、碳?xì)浠衔锏戎T多物質(zhì)等。

2.4.2 GC－MS檢測分析

利用頂空固相微萃取－氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測茂縣花椒揮發(fā)性香氣成分，結(jié)果見表4。

表4 茂縣花椒揮發(fā)性成分Table 4 The volatile components of Zanthoxylumin Maoxian

續(xù) 表

由表4可知，檢測到23種物質(zhì)，主要為酯類、醛類、烯類、醇類、酮類。其中，酯類共有5種，占總含量的3.148%；醛類只有1種，占總含量的0.014%；烯類共有12種，占總含量的34.783%；醇類共有4種，占32.045%；酮類也只檢測出1種，占總含量的0.024%?？傮w來說，茂縣大紅袍花椒中烯類物質(zhì)含量較多，其次是醇類和酯類物質(zhì)，醛類和酮類含量較少。實驗結(jié)果與陳訓(xùn)在研究茂縣大紅袍花椒油中的結(jié)果較為接近，但由于實驗條件的設(shè)置而稍有差異。

2.5 抑菌活性檢測

按照1.2.6實驗步驟，分別將花椒的水提液和醇提液用于抑菌實驗，得到各菌株抑菌檢測結(jié)果，見表5。

表5 茂縣花椒抑菌活性Table 5 The antibacterial activity of Zanthoxylumin Maoxian mm

由表5可知，花椒浸提液對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑菌活性，而對大腸桿菌和乙型副傷寒沙門氏菌沒有顯示抑制作用，其中枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌屬陽性菌，大腸桿菌和乙型副傷寒沙門氏菌屬革蘭氏陰性菌，說明花椒對陽性菌具有明顯的抑制作用，對陰性菌的抑菌活性不明顯。

3 結(jié)論與討論

本文對四川茂縣大紅袍花椒進行深入研究，得出茂縣花椒的水分含量為9.5%，總灰分含量為5.5%，達到國家規(guī)定的一級標(biāo)準(zhǔn)要求；總碳含量44.14%，總氮含量2.23%，碳氮比19.79；銨態(tài)氮含量13.56mg／kg，粗蛋白含量9.72g／100g；含有17種氨基酸，總量達到7.15%。紅外光譜分析說明其含有豐富的有機物，包括蛋白質(zhì)、酰胺和脂肪類等多種物質(zhì)。根據(jù)電子鼻檢測，其揮發(fā)性成分可能含有胺類化合物、碳氧化合物、碳?xì)浠衔锏戎T多物質(zhì)。利用頂空固相微萃?。瓪赓|(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測揮發(fā)性香氣成分，得到23種物質(zhì)，主要分為酯類、醛類、烯類、醇類、酮類等，進一步驗證了大紅袍花椒豐富的風(fēng)味成分。此外，對茂縣花椒的生物抑菌活性研究，得出其對陽性菌具有明顯的抑制作用，對陰性菌的抑菌活性不明顯。總之，該研究為茂縣花椒的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。另外，我們應(yīng)充分利用茂縣花椒的特點，尋找其新的活性成分，并探索更多的生物活性潛能，進而為茂縣花椒在食用、藥用、香精、化妝品等工業(yè)中的開發(fā)利用提供更多的科學(xué)依據(jù)。

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Study on Chemical Constituents and Antibacterial Activity of Zanthoxylum bungeanumin Maoxian

QIAO Ming－feng1，2，LIU Yang1＊，YUAN Xiao－jun1，YI Yu－wen1，PENG Yi－qin1，DENG Jing1
（1.Sichuan Tourism University，Chengdu 610100，China；2.Sichuan Province Key Laboratory of Ecological Restoration and Biodiversity Conservation，Key Laboratory of Mountain Ecological Restoration and Bioresource Utilization，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China）

Use a variety of detection methods for studying chemical composition and antibacterial activity of Zanthoxylum bungeanumin Maoxian.The results show that the moisture content is 9.5%，total ash content is 5.5%，total carbon content is 44.14%，total nitrogen content is 2.23%，carbon and nitrogen ratio is 19.79，ammonium nitrogen content is 13.56mg／kg，crude protein content is 9.72g／100g.It contains 17kinds of amino acids，and the total amount can reach 7.15%.The volatile components mainly contain esters，aldehydes，alkenes，alcohols，ketones and so on，which are analyzed by IR，E－nose and GC－MS qualitatively and quantitatively.The antibacterial activity studies show that it has a significant inhibitory effect on negative bacteria such as Bacillus ubtilis and Staphylococcus aureus，while has no significant antibacterial activity for negative bacteria such as Colibacillus and Salmonella paratyphi B.Carry out a systematic study and research on the chemical basis and biological activity of Zanthoxylum bungeanumin Maoxian，which could provide a theoretical foundation for its further development and application.

Zanthoxylum bungeanum in Maoxian；chemical constituents；volatile components；antibacterial activity

TS264.2

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.013

1000－9973（2017）04－0059－05

2016－10－17 ＊通訊作者

四川省哲學(xué)社會科學(xué)重點研究基地－川菜發(fā)展研究中心重點項目（CC16Z01）；烹飪科學(xué)四川省高等學(xué)校重點實驗室基金項目（PRKX2016Z02）；中國科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點實驗室開放基金（kxysws1601）

喬明鋒（1985－），男，講師，博士，研究方向：食品化學(xué)；劉陽（1990－），男，助教，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。