王明星 王 燕 趙京霞 底婷婷 阮智通 蒙玉嬌 謝湘江張 璐林 燕 王 寧 李 萍*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100027)

·基礎(chǔ)研究 ·

樹突狀細(xì)胞在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型中的表達(dá)及涼血解毒方的干預(yù)作用

王明星1,2王 燕2,3趙京霞1,2底婷婷2,3阮智通1,2蒙玉嬌1,2謝湘江2,3張 璐2林 燕2王 寧2李 萍2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010；2.銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市中醫(yī)研究所，北京 100010；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100027)

目的 觀察涼血解毒方對(duì)咪喹莫特(imiquimod, IMQ)誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型中活化的樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)的干預(yù)作用。方法 將小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，涼血解毒方高(Liangxue Jiedu groups with high， LXJD-H)、中(medium， LXJD-M)、低(low， LXJD-L)劑量組和甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)組，觀察小鼠背部皮損變化。采用銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度評(píng)分(psoriasis area and severity index，PASI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，光鏡下觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)變化，測(cè)量表皮厚度；免疫熒光及組織化學(xué)法檢測(cè)皮損中Ki67、CD3、CD11c的表達(dá)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟中DCs數(shù)量；酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的量；采用RT-PCR法檢測(cè)皮損組織中DCs相關(guān)受體基因水平；Western blotting法檢測(cè)小鼠皮損中TLR7/TLR8通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果 涼血解毒方明顯降低皮損PASI評(píng)分及表皮厚度、減少炎性反應(yīng)細(xì)胞的浸潤(rùn)；抑制皮損中TLR7通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；體內(nèi)外降低白細(xì)胞介素-23(interleukin-23,IL-23)、Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR7)、TLR8 及IL-12p40 mRNA表達(dá)及下調(diào)IL-23、IL-1β細(xì)胞因子分泌水平。結(jié)論 涼血解毒方可以改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損，且可以改善皮損中T淋巴細(xì)胞及DCs的浸潤(rùn)，同時(shí)抑制DCs的活化。

銀屑?。贿溧?；樹突狀細(xì)胞；涼血解毒方

銀屑病，中醫(yī)稱之為“白疕”，是臨床上常見的以鱗屑、浸潤(rùn)、紅斑為主要癥狀的皮膚病，近20年，我國(guó)的患病率由0.123%升至0.47%[1]。該病是由遺傳與環(huán)境等多個(gè)因素相互作用導(dǎo)致的慢性復(fù)發(fā)性的自身免疫性疾病，其主要病理特征表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增生和以T淋巴細(xì)胞為主的免疫系統(tǒng)的異?；罨痆2]。近 10 年的研究[3]顯示，DCs的異?；罨倾y屑病發(fā)病的上游環(huán)節(jié)：在銀屑病的皮損中，DCs的數(shù)量增多、活性增強(qiáng)，它們分泌大量的炎性細(xì)胞因子，可促使 T 淋巴細(xì)胞的激活，引發(fā)免疫反應(yīng)。此外，以DCs分泌的炎性反應(yīng)因子為靶點(diǎn)的特異性療法逐漸被用于臨床，與傳統(tǒng)的療法相比，具有更好的療效，這些研究結(jié)果和臨床療效都強(qiáng)調(diào)了DCs在銀屑病發(fā)病環(huán)節(jié)中的重要作用[4]。

中醫(yī)認(rèn)為臨床進(jìn)行期的銀屑病病人多屬血熱證，治療以清熱涼血解毒為主，代表方為涼血解毒方。隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的臨床研究[5]顯示，臨床愈顯率70.97%，明顯高于對(duì)照組。而目前對(duì)中醫(yī)藥治療銀屑病的機(jī)制研究多集中在調(diào)控 T 淋巴細(xì)胞的活化及角質(zhì)形成細(xì)胞的增生和凋亡等方面，對(duì)其上游的DCs研究較少。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠皮損模型，觀察中藥涼血解毒方是否可以通過抑制DCs的活化，下調(diào)細(xì)胞因子分泌水平，從而起到治療銀屑病的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

BALB/c 雌性小鼠36只，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(京)2014-0013，體質(zhì)量18～20 g。

1.2 細(xì)胞

DC2.4細(xì)胞株(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)。

1.3 試劑和藥物

涼血解毒方來自于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院協(xié)定處方(土茯苓30g，生槐花15 g，生地黃15 g，紫草10 g，赤芍10 g， 白茅根30 g， 苦參10 g， 金銀花15 g，草河車9 g，白鮮皮10 g)，組方按照成人(60 kg)的劑量，根據(jù)人與動(dòng)物間藥物劑量換算比例換算成小鼠灌胃用量。中藥材統(tǒng)一由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，以中藥常規(guī)煎服法制備中藥水煎劑；咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，批號(hào)：15020139)；甲氨蝶呤片(上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31020644)；凡士林(河北蘭煉飛天石化有限公司產(chǎn)品)；3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))H2O2去離子水、DAB顯色液(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；CD3單克隆抗體、增生細(xì)胞核抗原Ki67抗體、CD11c單克隆抗體(Abcam 公司，英國(guó))、CD11c-PE單克隆抗體(eBioscience公司，中國(guó)，上海)；抗鼠白細(xì)胞介素-23(interleukin-23,IL-23)一抗(Santa Cruz公司，美國(guó))，二抗購自中杉金橋生物技術(shù)公司；PCR試劑盒；Western blotting的抗體；CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學(xué)。

1.4 主要儀器

超低溫冰箱、脫水機(jī)、包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、圖像分析系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、PCR儀、紫外分光光度計(jì)、凝膠電泳成像系統(tǒng)、高速冷凍離心機(jī)等設(shè)備。

1.5 造模制備及分組給藥

1.5.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

參考van der Fits等[6]銀屑病樣小鼠模型制備方法。實(shí)驗(yàn)前腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(80 mg/kg)小鼠，背部去除面積約2 cm×2 cm的毛發(fā)，備皮后單籠飼養(yǎng)。采用數(shù)字表法，將備好皮的小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control)，模型組(model)，涼血解毒方(Liangxue Jiedu，LXJD)高、中、低劑量組和甲氨蝶呤(MTX)陽性藥物對(duì)照組，每組6只。正常對(duì)照組小鼠背部每日涂抹適量凡士林，其余各組小鼠背部每日涂抹4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))咪喹莫特乳膏420 ng；造模同時(shí)灌胃給藥，每天1次，每次0.2 mL，連續(xù)7 d，正常對(duì)照組與模型組給予0.2 mL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，涼血解毒方高、中、低劑量組分別給予等量的涼血解毒方溶液，濃度分別為2、1、0.5 mg·kg-1·d-1(按成人劑量換算為小鼠用量制備的水煎劑為涼血解毒方中劑量 1 mg·kg-1·d-1，中劑量的1/2為低劑量，中劑量的2倍為高劑量)；MTX組給予1 mg·kg-1·d-1甲氨蝶呤片溶液。

1.5.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

DC2.4細(xì)胞的培養(yǎng)：DC2.4細(xì)胞應(yīng)用含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期換液及觀察細(xì)胞形態(tài)，傳代2～3次，選取處于旺盛生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞備用。

噴霧干燥法制備涼血解毒方水煎劑粉末：噴霧干燥技術(shù)是應(yīng)用高壓泵將藥液從霧化器噴出，形成霧狀微粒，該霧狀微粒與熱空氣直接接觸后，絕大部分水瞬時(shí)蒸發(fā)，水蒸氣隨即被抽氣裝置抽走，干燥的提取物粉末被收集在收集管內(nèi)。該方法樣品與熱空氣接觸時(shí)間極短，最大限度保留了熱敏感成分。同時(shí)所得樣品為較均勻的粉末，省去一般干燥法中粉碎過程。

涼血解毒方藥物濃度篩選：用CCK-8法(CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學(xué))篩選出涼血解毒方對(duì)細(xì)胞沒有毒性作用的濃度：采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的DC2.4細(xì)胞株，加入 96 孔板中，加入不同濃度的中藥，37 ℃、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2條件下培養(yǎng) 24、48、72 h。檢測(cè)前3 h，每孔加入 10μL CCK-8，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度值。以篩選出的藥物濃度分為高、中、低3個(gè)劑量進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

按照篩選出的藥物濃度分為：① 空白對(duì)照組：不用中藥干預(yù)也不用R848進(jìn)行刺激；② 模型組：用TLR7/8的激動(dòng)劑R848刺激細(xì)胞24 h；③ 中藥高濃度+R848刺激組：高濃度中藥預(yù)先作用細(xì)胞24 h，再以R848刺激24 h；④ 中藥中濃度+R848刺激組：中濃度中藥預(yù)先作用細(xì)胞24 h，再以R848刺激24 h；⑤ 中藥低濃度+R848刺激組：低濃度中藥預(yù)先作用細(xì)胞24 h，再以R848刺激24 h。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1)小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分：每天采用數(shù)碼相機(jī)拍照的方法記錄皮損變化情況，并依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0(無)：表面無紅斑鱗屑可見、皮損與正常皮膚平齊；1(輕度)：部分皮損表面上覆有鱗屑，以細(xì)碎鱗屑為主、皮損輕微高于正常皮膚表面、呈淡紅色；2(中等度)：大多數(shù)皮損表面完全或不完全覆有鱗屑，鱗屑呈片狀、中等度隆起，斑塊的邊緣為圓或斜坡形、紅色；3(重度)：幾乎全部皮損表面覆有鱗屑，鱗屑較厚呈層、皮損肥厚，隆起明顯、深紅色；4(極重度)：全部皮損。對(duì)各組小鼠皮損進(jìn)行鱗屑、浸潤(rùn)及紅斑嚴(yán)重程度的評(píng)分，將三者積分相加得到總積分，取各組積分平均值后繪制皮損積分趨勢(shì)線，觀察小鼠皮損的變化情況。

2)小鼠皮損組織形態(tài)學(xué)觀察：于造模給藥后第7天，取小鼠背部皮損組織，用10%(體積分?jǐn)?shù))甲醛固定，石蠟包埋、切片后經(jīng)蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色，在光鏡下觀察小鼠皮損的病理學(xué)變化。采用IPP 6.0圖像分析軟件，每組選用4個(gè)標(biāo)本切片進(jìn)行觀察并照相，并在每張切片中隨機(jī)測(cè)量5處表皮厚度，并利用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件繪制表示皮損增厚程度的柱狀圖觀察。

3)小鼠皮損表皮層異常增生分化的檢測(cè)：利用免疫熒光法(immunofluorescence，IF)對(duì)小鼠皮損組織石蠟切片進(jìn)行Ki67染色，并且觀察各組小鼠皮損處Ki67的表達(dá)情況。

4)小鼠皮損中T淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)的檢測(cè)：利用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry，IHC)對(duì)小鼠皮損組織石蠟切片進(jìn)行CD3染色，觀察各組小鼠皮損中CD3表達(dá)情況；小鼠皮損經(jīng) OCT (opti-mum cutting temperature compound) 包埋做冰凍切片，預(yù)冷的丙酮固定CD11c、抗體孵育、 DAB 顯色。切片采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，觀察各組小鼠皮損中CD11c的表達(dá)情況。

5)小鼠皮損中白細(xì)胞介素-23(interleukin-23， IL-23)、IL-12p40法：按TRIzol試劑說明書提取組織mRNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time polymerase chain reaction)法檢測(cè)。

6)小鼠脾臟細(xì)胞中CD11c+細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)：常規(guī)分離各組小鼠脾臟細(xì)胞，獲得脾細(xì)胞懸液加入CD11c-PE單克隆抗體，室溫下避光放置30 min，離心洗滌重懸，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析。

7)小鼠皮損中TLR7通路相關(guān)蛋白TLR7表達(dá)的檢測(cè)：Western blotting法，裂解提取總蛋白，BCA法蛋白定量。將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，利用特異性的抗體和熒光二抗檢測(cè)，反應(yīng)信號(hào)經(jīng)Odssey遠(yuǎn)紅外成像儀檢測(cè)。

1.6.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1)樹突狀細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-23、IL-1β檢測(cè)：收集各組細(xì)胞上清液，按照酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒方法檢測(cè)。

2)樹突狀細(xì)胞表面IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA表達(dá)檢測(cè)：收集各組細(xì)胞，按TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞mRNA，采用RT-PCR法檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 涼血解毒方對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損鱗屑、浸潤(rùn)、紅斑及皮損總積分的影響

小鼠背部涂抹IMQ 7 d，觀察各組小鼠皮損變化。正常對(duì)照組小鼠背部皮膚粉嫩、光滑，皮膚薄(圖1A)；模型組小鼠背部皮損增厚、浸潤(rùn)，出現(xiàn)皺褶，并附有一層片狀鱗屑，易脫落，脫落后可見針狀出血點(diǎn)，部分皮膚紅斑突起，甚至肥厚融合成斑塊(圖1B)；MTX組小鼠與模型組對(duì)比，皮損癥狀明顯改善：皮膚增厚減輕，鱗屑較少明顯，紅斑面積減小、顏色變淺(圖1C)；LXJD-H、M、L組與模型組小鼠相比，皮損癥狀均明顯減輕，鱗屑減少，紅斑面積較小，顏色較淡，浸潤(rùn)肥厚減輕(圖1D-F)；肉眼觀察發(fā)現(xiàn)LXJD-L組與MTX組小鼠背部皮損癥狀相似。

圖1 涼血解毒方治療7 d對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損的影響

A:control;B:model; C:MTX:methotrexate; D: LXJD-H:Liangxue Jiedu-high; E: LXJD-M: Liangxue Jiedu-medium; F: LXJD-L: Liangxue Jiedu-low；IMQ: imiquimod.

依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，并采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制趨勢(shì)線，見圖2。實(shí)驗(yàn)過程中，空白對(duì)照組小鼠背部皮膚均無鱗屑、浸潤(rùn)及紅斑的改變；模型組小鼠在IMQ涂抹2 d后皮膚即出現(xiàn)微小的紅斑，3 d后出現(xiàn)細(xì)小鱗屑，皮膚出現(xiàn)增厚。隨著IMQ藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組小鼠皮損加重，出現(xiàn)片狀鱗屑，皮膚增厚隆起明顯，并且出現(xiàn)大面積深紅色紅斑，出現(xiàn)類似銀屑病樣皮損，評(píng)分于6～7 d達(dá)到高峰；MTX組小鼠皮膚各項(xiàng)積分都明顯低于同期模型組，尤其浸潤(rùn)、紅斑積分明顯下降(分別P<0.05)；IMQ涂抹3 d后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，MTX組及LXJD-M、L組小鼠皮損的鱗屑(F=10.414，P<0.05)、浸潤(rùn)(F=9.981,P<0.05)、紅斑(F=9.842,P<0.05)及總積分(F=14.462,P<0.05)均明顯降低(P<0.05)，趨勢(shì)圖中可以看出MTX組及LXJD-L組降低皮損積分的作用更為顯著(P<0.05)。與MTX組對(duì)比，LXJD-L組降低小鼠皮損各項(xiàng)積分的作用與MTX組類似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 涼血解毒方對(duì)IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮損動(dòng)物模型組織學(xué)病理變化的影響

HE 染色結(jié)果顯示：治療7 d 時(shí)，空白對(duì)照組小鼠皮膚表皮層較薄，僅2 ～3 層(圖3A)。模型組可見細(xì)胞成熟增多，達(dá)7～8層，伴角化不全，表皮棘細(xì)胞層的增厚，同時(shí)基底細(xì)胞核分裂像較多(圖3B)。對(duì)比模型組，MTX組與LXJD各濃度組小鼠皮損表皮層厚度明顯減少，核分裂像局限基底，角化不全減少，血管增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減少，但各組間無明顯劑量依賴關(guān)系，且皮損表現(xiàn)與MTX組接近(圖 3C-F)。

通過IPP測(cè)量各組小鼠表皮層的垂直厚度發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組小鼠表皮厚度為(11.83±2.42)μm,，模型組小鼠表皮厚度為(73.92±23.74)μm，與空白對(duì)照組對(duì)比，模型組表皮層明顯增厚(P<0.001)，約為正常對(duì)照組小鼠表皮厚度的7倍；治療后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，MTX組及LXJD各組小鼠表皮厚度均明顯降低(F=398.2，P<0.0001)；與MTX組對(duì)比，LXJD-M、L組降低小鼠表皮厚度作用均明顯優(yōu)于MTX組(P<0.05)，LXJD-H作用不及MTX組(P>0.05)。進(jìn)一步對(duì)比LXJD各濃度組的作用發(fā)現(xiàn)，LXJD-L組優(yōu)于LXJD-M組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；故提示LXJD-L組抑制小鼠表皮增厚的作用最為明顯。詳見表1。

圖2 涼血解毒方對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損PASI評(píng)分的影響

A:scales; B:infiltration;C:erythema; D:total scores; IMQ:imiquimod；PASI：psoriasis area and severity index.

圖3 涼血解毒方治療7 d后各組IMQ(Imiquimod)誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損組織學(xué)改變

A:control；B:model；C:MTX (methotrexate); D: LXJD-H:Liangxue Jiedu-high; E: LXJD-M:Liangxue Jiedu-medium; F: LXJD-L:Liangxue Jiedu-low; IMQ:imiquimod.

2.3 涼血解毒方對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損中 Ki67表達(dá)的影響

Ki67是一種增生細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，陽性細(xì)胞胞核呈綠色熒光。空白對(duì)照組小鼠皮膚僅基底層細(xì)胞表達(dá)，呈線狀排列(圖4A)。模型組表皮細(xì)胞在基底層、顆粒層均有表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，約為空白對(duì)照組的3倍(P<0.01)(圖4B)；各組治療后顯示，MTX組及LXJD-M、L組小鼠表皮層中Ki67陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)均比MTX組明顯減少(F=10.84，分別P<0.01)；其中LXJD-M、L組的作用接近MTX組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖4C～F及表2。

表1 涼血解毒方治療7 d后imiquimod 誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損表皮層厚度比較

GroupEpidermisthicknessControl11．83±2．42???Model73．92±23．74LXJD?L36．56±9．21???##△△LXJD?M45．55±10．17???##△LXJD?H54．79±11．48???##△△△MTX41．31±11．79???##

***P<0.001vsmodel；##P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001vsMTX.LXJD-L:Liangxue Jiedu-low； LXJD-M:Liangxue Jiedu-medium； LXJD-H:Liangxue Jiedu-high； MTX:methotrexate.

2.4 涼血解毒方對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

1)小鼠皮損IHC染色觀察：CD3陽性細(xì)胞浸潤(rùn)情況：與空白組相比，模型組小鼠真皮層褐色沉淀顆粒CD3明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，各治療組小鼠皮損真皮層中CD3陽性細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.07，分別P<0.01)；與MTX組相比，LXJD方3個(gè)劑量組小鼠皮損中CD3陽性細(xì)胞數(shù)量接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；說明LXJD與MTX組療效相似。詳見圖5及表2。

CD11c+細(xì)胞浸潤(rùn)情況：與空白組相比，模型組小鼠皮損中CD11c+浸潤(rùn)明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，各治療組小鼠皮損中CD11c+細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量明顯降低(F=26.43，P<0.05)；與MTX組相比，LXJD-M、L組小鼠皮損中CD11c+細(xì)胞數(shù)量與MTX組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而LXJD-H組與MTX組對(duì)比CD11c+細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，根據(jù)數(shù)據(jù)說明LXJD-H組作用不及MTX組；LXJD方各濃度之間對(duì)比顯示，LXJD-M、L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，作用相似(P>0.05)，LXJD-H、L組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LXJD-L組降低小鼠真皮中CD11c+作用明顯優(yōu)于LXJD-H組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖 6及表2。

圖4 涼血解毒方治療7d各組imiquimod誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損Ki67表達(dá)情況

Blue:DAPI, Green: Alexa Fluor 488; A:control， B:model，C: MTX(methotrexate); D: LXJD-H(Liangxue Jiedu-high); E: LXJD-M(Liangxue Jiedu-medium); F: LXJD-L(Liangxue Jiedu-low).

表2 各組治療7 d后小鼠皮損中Ki67、CD3+、CD11c+的表達(dá)

GroupKi67CD3+CD11c+Control11．50±3．1510．69±2．6914．69±2．30Model32．20±8．43???40．44±8．13???33．64±7．21???LXJD-L22．17±3．37?#18．53±5．32??###20．53±4．63###LXJD-M23．50±3．25??#23．79±3．89???###24．62±4．57???###LXJD-H25．50±7．87??23．89±3．89???###30．85±4．41???△△MTX18．43±4．47###21．53±6．64???###21．78±7．60??###

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vscontrol；###P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsMTX. LXJD-L:Liangxue Jiedu-low; LXJD-M:Liangxue Jiedu-medium; LXJD-H:Liangxue Jiedu-high;MTX:methotrexate.

2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟CD11c細(xì)胞數(shù)量：在前向角和側(cè)向角散點(diǎn)圖中，圈入排除碎片及粘連細(xì)胞的所有細(xì)胞，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠脾臟中CD11c+細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，MTX組及LXJD作用7 d后，各治療組小鼠脾臟中CD11c+細(xì)胞數(shù)少于模型組，其中MTX組較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖7)。

圖5 涼血解毒方治療7d各組小鼠 imiquimod 誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損真皮層CD3細(xì)胞表達(dá)情況

A:control； B:model； C:MTX (methotrexate); D: LXJD-H(Liangxue Jiedu-high); E: LXJD-M(Liangxue Jiedu-medium); F: LXJD-L(Liangxue Jiedu-low).

圖6 涼血解毒方治療 7 d各組小鼠 imiquimod誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損真皮層CD11c+細(xì)胞表達(dá)情況

A:control; B:model; C: MTX(methotrexate); D: LXJD-H(Liangxue Jiedu-high); E: LXJD-M(Liangxue Jiedu-medium); F: LXJD-L(Liangxue Jiedu-low).

圖7 涼血解毒方治療7 d后各組imiquimod 誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠脾臟中CD11c+細(xì)胞數(shù)量

2.5 涼血解毒方對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損IL-23、IL-12p40、TLR7及TLR8 mRNA表達(dá)水平的影響

PCR法檢測(cè)小鼠皮損中IL-23、IL-12p40、TLR7及TLR8 mRNA表達(dá)水平顯示：與空白組相比，模型組小鼠的皮損中IL-23、IL-12p40、TLR7及TLR8 mRNA水平均明顯增高(P<0.05)，其中IL-23 mRNA表達(dá)水平約為空白組小鼠的2倍，TLR8 mRNA水平約為空白組小鼠的3倍，TLR7、IL-12p40 mRNA 表達(dá)水平約為空白組小鼠的4倍。與模型組相比，MTX組及LXJD組小鼠皮損中IL-23(F=6.61,P<0.05)、IL-12p40(F=19.00,P<0.05)、TLR7(F=11.67,P<0.05)及TLR8 mRNA(F=22.45,P<0.05)表達(dá)明顯降低。MTX組在下調(diào)IL-12p40 mRNA表達(dá)水平方面作用優(yōu)于LXJD-H、M組(分別P<0.05)；在下調(diào)IL-23、TLR7及TLR8 mRNA表達(dá)水平方面，MTX組與LXJD各濃度組相似(P>0.05)。詳見圖8。

圖8 涼血解毒方治療7 d各組imiquimod 誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損中相關(guān)受體基因水平的比較

A:the relative expression of IL-23 mRNA; B:the relative expression of TLR7; C:the relative expression of TLR8;D:the relative expression of IL-12p40 mRNA.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group ;LXJD-L:Liangxue Jiedu-low; LXJD-M:Liangxue Jiedu-medium; LXJD-H:Liangxue Jiedu-high; MTX:methotrexate；IL-23：interleukin-23.

2.6 涼血解毒方對(duì)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損中TLR7通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

模型組TLR7的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比有所增高；與模型組相比，MTX組及LXJD組均可以降低TLR7蛋白的表達(dá)，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MTX組與LXJD組降低TLR7蛋白表達(dá)作用相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.3471，P>0.05)(圖9)。

2.7 涼血解毒方體外對(duì)DC2.4分泌細(xì)胞因子IL-23、IL-1β的影響

與空白組相比，經(jīng)R848刺激DC2.4細(xì)胞后，IL-23、IL-1β等細(xì)胞因子的分泌明顯增多；與R848刺激DC2.4細(xì)胞組相比，加入中藥涼血解毒方后IL-23、IL-1β分泌量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=199.3，P<0.01)，且涼血解毒方各濃度間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明涼血解毒方可以直接作用于DC2.4細(xì)胞并抑制其分泌IL-23、IL-1β等細(xì)胞因子(圖10)。

2.8 涼血解毒方對(duì)DC2.4細(xì)胞IL-23、IL-12p40、IL-1β mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)R848刺激DC2.4細(xì)胞后，細(xì)胞表面IL-23(F=5.341，P<0.05)、IL-12p40(F=25.86，P<0.01)、IL-1βmRNA(F=40.38，P<0.01)表達(dá)明顯增加；與R848組相比，中藥LXJD方直接作用DC2.4細(xì)胞后，IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；LXJD方各濃度間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明中藥LXJD方可以作用于DC2.4細(xì)胞并抑制細(xì)胞表面IL-23、IL-12p40、IL-1βmRNA的表達(dá)(圖11)。

圖9 涼血解毒方治療7 d后各組imiquimod誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損中TLR7蛋白表達(dá)量

LXJD:Liangxue Jiedu；MTX:methotrexate.

圖10 涼血解毒方對(duì)DC2.4分泌的細(xì)胞因子的影響

Groups: 10 ng/mL R848, 10 ng/mL R848 + LXJD-H (Liangxue Jiedu-high) (2.5 μg/mL), 10 ng/mL R848 + LXJD-M (Liangxue Jiedu-medium) (1.25 μg/mL), 10 ng/mL R848 + LXJD-L (Liangxue Jiedu-low)(0.625μg/mL) for 24 h. A:The secretion of IL-23; B:The secretion of IL-1β.***P<0.001vsR848 group. LXJD-H+R:Liangxue Jiedu-high+R848; LXJD-M+R:Liangxue Jiedu-medium+R848;LXJD-L+R:Liangxue Jiedu-low+R848.

圖11 涼血解毒方對(duì)DC2.4細(xì)胞IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA表達(dá)的影響 分組

Groups:10 ng/mL R848, 10 ng/mL R848 + LXJD-H (Liangxue Jiedu-high) (2.5 μg/mL), 10 ng/mL R848 + LXJD-M (Liangxue Jiedu-medium) (1.25 μg/mL), 10 ng/mL R848 + LXJD-L (Liangxue Jiedu-low)(0.625 μg/mL) for 24 h. A:the fold change mRNA expression of IL-23 mRNA; B:the fold change mRNA expression of IL-1βmRNA; C:the fold change mRNA expression of IL-12p40 mRNA.*P<0.05，***P<0.001vsR848 group； IL：interleukin.

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性炎性反應(yīng)性皮膚病，它屬于與多種基因相關(guān)的遺傳性疾病，其主要病理變化為表皮角化過度及角化不全，角化不全區(qū)域內(nèi)可見中性白細(xì)胞構(gòu)成的小膿腫，稱Munro氏小膿腫；顆粒層明顯減少或消失；棘層增厚；表皮突延伸；乳頭內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血[7]。目前有研究[8-9]表明，DCs的異?；罨c銀屑病的發(fā)生密切相關(guān)，DCs是目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，通過分泌不同的細(xì)胞因子啟動(dòng)和調(diào)節(jié)固有和獲得性免疫應(yīng)答，它可以分泌多種細(xì)胞因子，如TNF-a、IFN-γ、IL-12、IL-23等。有研究[10-11]證實(shí)：DCs 通過分泌以IL-12 為主的細(xì)胞因子來誘導(dǎo)或促進(jìn)初始T 細(xì)胞分化為Th1類細(xì)胞，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答[10]；同時(shí)也可通過分泌以IL-1β為主的細(xì)胞因子，促進(jìn)T、B 細(xì)胞的活化[11]。然而，在其分泌的眾多細(xì)胞因子中，與銀屑病發(fā)病關(guān)系最為密切的為IL-12和IL-23。IL-23是IL-12細(xì)胞因子家族的新成員，由p19和p40組成異源二聚體分子，是T輔助細(xì)胞的始動(dòng)因素[12]。檢測(cè)銀屑病病人皮損區(qū)可發(fā)現(xiàn)IL-23 mRNA在角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮層有表達(dá)，其表達(dá)高于正常人皮膚及病人非皮損區(qū)的皮膚[13]。綜上所述，銀屑病的發(fā)病是由于DCs的異?；罨?，其所分泌的IL-12、IL-23進(jìn)一步引發(fā) T 淋巴細(xì)胞的活化，而活化的DCs及T細(xì)胞共同分泌眾多細(xì)胞因子、化學(xué)增活素及生長(zhǎng)因子，在局部構(gòu)成 “細(xì)胞因子風(fēng)暴”，一場(chǎng)惡性循環(huán)在附近的角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、免疫細(xì)胞中發(fā)生，最終共同導(dǎo)致銀屑病皮損的形成[14-15]。

IMQ是TLR7、TLR8受體的激動(dòng)劑，可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)DCs的成熟和分泌，進(jìn)一步激活皮損周圍T淋巴細(xì)胞的活化，從而導(dǎo)致自身性免疫反應(yīng)，最終引起紅斑、鱗屑及皮損浸潤(rùn)肥厚等病理改變，如表皮棘層細(xì)胞的大量增生、角化不全，并伴有微膿腫的形成、真皮層毛細(xì)血管增生、擴(kuò)張以及大量淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)等類似銀屑病的病理特征[16]。故選用此模型進(jìn)行探索研究。

本研究結(jié)果顯示，LXJD方可明顯改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損癥狀；HE的結(jié)果提示，涼血解毒方可以顯著抑制表皮細(xì)胞的增生、角化不全及真皮淺層的毛細(xì)血管擴(kuò)張；顯著抑制異?；钴S的角質(zhì)形成細(xì)胞的增生；同時(shí)還可以降低小鼠脾臟中CD11c+及皮損中CD3和CD11c+的浸潤(rùn)。提示LXJD方通過抑制DCs的活化及T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而發(fā)揮改善銀屑病樣小鼠皮損的作用。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究顯示，LXJD方可以降低小鼠皮損中IL-23、IL-12p40、TLR7及TLR8 mRNA的表達(dá)，尤其是可顯著抑制IL-23、IL-12p40 mRNA的表達(dá)。提示涼血解毒方具有抑制DCs的活化及其產(chǎn)生IL-23、IL-12等細(xì)胞因子的能力。那么涼血解毒方是否可以直接抑制DCs的活化？筆者通過體外實(shí)驗(yàn)直接觀察了涼血解毒方對(duì)DC2.4細(xì)胞的干預(yù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LXJD方可以降低細(xì)胞上清液中IL-23、IL-1β細(xì)胞因子，同時(shí)可以明顯降低細(xì)胞中IL-23、IL-1β、IL-12p40 等mRNA表達(dá)。這些結(jié)果均證實(shí)LXJD方可以直接抑制DCs的活化。

然而在TLR7通路相關(guān)蛋白的檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠與皮損中TLR7的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比有所增高，MTX組小鼠與模型組相比，小鼠皮損中TLR7的表達(dá)較少，LXJD方組小鼠與模型組相比，小鼠皮損中TLR7的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，推測(cè)LXJD方治療銀屑病可能不是通過抑制TLR7通路實(shí)現(xiàn)的，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中筆者會(huì)進(jìn)一步對(duì)TLR8通路進(jìn)行檢測(cè)，以探討藥物作用的靶點(diǎn)。由此筆者推斷LXJD方治療銀屑病的機(jī)制之一可能是抑制了DCs的活化。

LXJD方中主要成分是由生地黃、生槐花、紫草、赤芍、土茯苓、金銀花等組成；以往的研究[17]顯示，紫草的主要成分紫草素可以抑制人外周血單核細(xì)胞來源的DCs表型CD80及CD86的表達(dá)，同時(shí)抑制DCs促淋巴細(xì)胞增生的能力及LPS和INF-γ聯(lián)合誘導(dǎo)的DCs對(duì)IL-23的分泌。同時(shí)研究[18]顯示，涼血中藥紫草的主要成分紫草素及阿卡寧通過抑制DCs的成熟，降低其細(xì)胞表面成熟分子標(biāo)志的表達(dá)，抑制其分泌IL-6、IL-23，干預(yù)DCs的功能，從而改善TLR7、8激動(dòng)劑IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損，發(fā)揮治療銀屑病的作用。這些研究均提示LXJD方中的有效成分對(duì)DCs的異常活化有抑制作用。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)可以得出如下結(jié)論：涼血解毒方可以改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損，可以改善皮損中T淋巴細(xì)胞及DCs的浸潤(rùn)，同時(shí)抑制DCs的活化。

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編輯 陳瑞芳

Dendritic cells on mice psoriasis-like lesions induced by imiquimod and the effects of Liangxue Jiedu decoction

Wang Mingxing1,2, Wang Yan2,3,Zhao Jingxia1,2, Di Tingting2,3, Ruan Zhitong1,2, Meng Yujiao1,2, Xie Xiangjiang2,3, Zhang Lu2, Lin Yan2, Wang Ning2, Li Ping2*

(1.BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofClinicandBasicResearchwithTraditionalChineseMedicineonPsoriasis,BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,Beijing100010,China; 3.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100027,China)

Objective To observe the effects of Liangxue Jiedu decoction(LXJD) on the abnormal activation of dendritic cells on mice psoriasis-like lesions induced by imiquimod. Methods Thirty-six BALB/c mice were randomly divided into six groups: control group, model group, Liangxue Jiedu groups with high(LXJD-H)，medium(LXJD-M) or low(LXJD-L) doses, and Methotrexate (MTX) group. The lesions were evaluated according to the psoriasis area and severity index(PASI). The histology and epidermal thicknesses were observed under light microscope．The expression of Ki-67 protein was detected by influorescent antibody technique. Meanwhile, the positive expression of CD3, CD11c was counted by immunohistochemical staining．The expression of dendritic cells in mouse spleen cells and the content of IL-23, IL-12p40, IL-1β in DC2.4 by flow cytometry. The IL-23 mRNA, TLR7, TLR8 were detected by PCR. The expression of TLR7 protein was detected by Western blotting. Results Compared with model group, the cutaneous symptoms in LXJD capsules groups were alleviated, with PASI scores decreased, epidermal parakeratosis and epidermal over-proliferation, the numbers of dermal T lymphocytes, dendritic cells reduced significantly．Compared with model group, the number of Ki67, CD3 and CD11c+in LXJD group was reduced obviously. Meanwhile the expression of IL-23, TLR7, TLR8 and IL-12p40 were all decreased compared with model group. Then in the cell experiment the secretion of cytokines IL-23 and IL-1β were all decreased. Conclusion Liangxue Jiedu Decoction could improve IMQ-induced mouse psoriasis-like lesions and ameliorate the infiltration of T cells and DCs in psoriasis-like lesions, While inhibiting the activation of DCs.

psoriasis; imiquimod; dendritic cell; Liangxue Jiedu

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81403410)，北京市科技計(jì)劃課題“十病十藥”研發(fā) (Z141100002214015)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China Youth Fund (81403410), Beijing Project of Science and Technology Plan (Z141100002214015).

時(shí)間：2017-04-13 20∶32

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2032.064.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.019]

R289.5

2016-12-07)

*Corresponding author， E-mail：liping411@ 126.com