王穎娟，張 培，李子忠，羅麗平（.興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院民族藥用生物資源研究與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，貴州興義 56400；.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴陽 55005）

蟻獅多糖的提取工藝及體內(nèi)免疫活性研究Δ

王穎娟1＊，張 培1，李子忠2，羅麗平2（1.興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院民族藥用生物資源研究與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室，貴州興義 562400；2.貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴陽 550025）

目的：優(yōu)化蟻獅多糖的提取工藝，探究其對小鼠免疫功能的影響。方法：以蟻獅多糖含量為考察指標(biāo)，比較水提取法、蛋白酶水解提取法（以酶用量、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)選）和稀堿液提取法（以堿液濃度、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)選）提取蟻獅多糖的效果。取128只KM小鼠隨機(jī)分為4個(gè)研究組，每個(gè)研究組隨機(jī)分為對照組（等體積生理鹽水）與蟻獅多糖低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg），每組8只，尾靜脈iv給藥，0.2 mL/10 g，每日1次，連用1周，分別用于測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率與吞噬指數(shù)、脾和胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和血清溶血素水平。結(jié)果：3種方法所得提取液中蟻獅多糖含量分別為14.48%、38.66%、30.62%。蛋白酶水解提取法所得蟻獅多糖含量最高，其最優(yōu)提取工藝條件為40℃下用100 μg/g的木瓜蛋白酶提取3 h。與對照組比較，蟻獅多糖低、中、高劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)、脾指數(shù)顯著升高（P＜0.05），胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05），而淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率無顯著變化（P＞0.05）；蟻獅多糖中劑量組小鼠血清溶血素水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論：蛋白酶水解提取法適于蟻獅多糖的提取，其優(yōu)選工藝可靠。蟻獅多糖具有增強(qiáng)小鼠非特異性免疫、體液免疫的活性。

蟻獅；多糖；提取方法；免疫活性

蟻獅（Antlion），別名地牯牛、沙猴、倒退蟲、沙牛等，隸屬脈翅目（Neuroptera）蟻蛉科（Myrmeleontidae），是一種藥用價(jià)值很高的昆蟲。其有平肝熄風(fēng)、解熱鎮(zhèn)痙、祛瘀散結(jié)、拔毒消腫、通便瀉下、截瘧殺蟲之功效，主治小兒高熱驚厥、癲癇、中風(fēng)等癥[1-2]。蟻獅作為傳統(tǒng)的藥用昆蟲，全蟲入藥，但其有效部位尚不明確。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，蟻獅體內(nèi)的多糖類物質(zhì)具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用[3]，多項(xiàng)研究表明植物多糖、菌類多糖具有增強(qiáng)免疫的活性，筆者據(jù)此推測蟻獅多糖也有類似活性，而其提取工藝是獲取多糖及活性考察的基礎(chǔ)。因此，筆者在本研究中比較了水提取法、正交試驗(yàn)優(yōu)化后的蛋白酶水解提取法和稀堿液提取法3種方法提取蟻獅多糖的效果，并探討其在小鼠體內(nèi)的免疫活性，以為蟻獅藥用資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

8453E型紫外-可見分光光度計(jì)（美國Aglient公司）；FA2004型電子天平（上海精天電子儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

蟻獅采自貴州省貴陽市森林公園，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王心麗教授鑒定為銹翅蟻蛉（Myrmeleon ferrugineipennis）幼蟲[室內(nèi)飼養(yǎng)至3齡（幼蟲期最后1個(gè)齡期）后，先用蒸餾水洗去蟲體表面的沙土，用75%乙醇潤洗消毒，去離子水淋洗2遍，晾干體表水分，稱質(zhì)量，5.0 g分裝，置于－80℃冰箱中保存，備用]；瑞氏染液（成都市邁克科技有限公司，批號(hào)：1307025）；植物血球凝集素（PHA，美國Sigma公司，批號(hào)：RT00281）；木瓜蛋白酶（上海佳和生物科技有限公司，批號(hào)：CF4772）；5%雞紅細(xì)胞（CRBC，廣州鴻泉生物科技有限公司，批號(hào)：141021）；氫氧化鈉、無水乙醇、葡萄糖、石油醚等均為國產(chǎn)分析純；水為去離子水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠128只，♂♀各半，購于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黔）2012-0001；使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2012-0001]。

2 方法

2.1 蟻獅多糖的制備

精密稱定蟻獅1.0 g，置于石油醚中回流脫脂、過濾，收集蟲體，以水（或木瓜蛋白酶、稀堿液）為介質(zhì)，按1∶10料液比，靜置抽提6 h，過濾，濾液體積濃縮至原體積的1/3，然后加入4倍體積的95%乙醇混勻后，靜置12 h，離心（離心半徑7.5 cm，8 000 r/min）20 min。取沉淀，用無水乙醇洗脫2次，揮發(fā)乙醇后，用去離子水溶解并定容至50 mL，即得蟻獅多糖粗提液。

2.2 蟻獅多糖含量測定

采用硫酸-苯酚法測定粗提物中多糖含量[4]。精密稱定105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖1.0 g，以去離子水溶解、定容至200 mL量瓶中，即得質(zhì)量濃度為5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖貯備液；精確吸取10 mL貯備液至200 mL量瓶中，以去離子水定容，即得質(zhì)量濃度為250 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于比色管中，各自加入去離子水使體積為1.0 mL，再加入5%的苯酚1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸3.25 mL，室溫（25℃）顯色25 min左右。另取去離子水1.0 mL同上操作后作為空白對照。于490 nm波長處測定吸光度（A），以葡萄糖質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A＝0.000 4x－0.006 5（r＝0.997 9），據(jù)此計(jì)算蟻獅多糖含量。

2.3 蟻獅多糖提取工藝優(yōu)化

2.3.1 水提取工藝 精確稱取5.0 g蟻獅幼蟲，按“2.1”項(xiàng)下方法，于100℃下[5]進(jìn)行水提取。

2.3.2 蛋白酶水解提取工藝 動(dòng)物組織中的多糖常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，蛋白酶能水解多糖與蛋白質(zhì)的連接鍵而分離多糖[6-7]。本試驗(yàn)采用木瓜蛋白酶，以蟻獅多糖含量為指標(biāo)，選擇提取溫度、酶用量、提取時(shí)間為考察因素（根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定），每個(gè)因素選擇3個(gè)水平。精確稱取蟻獅各5.0 g，共9份，按“3.2”項(xiàng)下正交表進(jìn)行蛋白酶水解提取[8]。

2.3.3 稀堿液提取工藝 以蟻獅多糖提取量為指標(biāo)，選擇堿液濃度、提取溫度、提取時(shí)間為考察因素（根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定），每個(gè)因素選擇3個(gè)水平。精確稱取蟻獅各5.0 g，共9份，按“3.3”項(xiàng)下正交表進(jìn)行稀堿液提取[9]。

2.4 蟻獅多糖免疫活性測定

2.4.1 蟻獅多糖溶液的制備及動(dòng)物分組、給藥 按“3.2”項(xiàng)下優(yōu)化的提取方案提取蟻獅多糖，結(jié)果蟻獅多糖含量為37.8%，蟻獅多糖得率為8.5%。根據(jù)文獻(xiàn)[10]，成年人（體質(zhì)量60 kg）每日口服7.5 g蟻獅，相當(dāng)人每1 kg體質(zhì)量口服4 mg蟻獅多糖，以成人攝入量的5、10、20倍[11]設(shè)置小鼠給藥的低、中、高劑量，即20、40、80 mg/kg，折算為原動(dòng)物生藥含量分別為625、1 250、2 500 mg/kg。

“2.4.2”～“2.4.5”每項(xiàng)研究分別取KM小鼠32只，♂♀各半，隨機(jī)分為對照組與蟻獅多糖低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg），每組8只。各組小鼠尾靜脈iv給藥，0.2 mL/10 g，每日1次，連用1周；對照組小鼠尾靜脈iv等體積生理鹽水。

2.4.2 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定 末次給藥后，各組小鼠ip 5%CRBC 0.5 mL，3 h后頸椎脫臼處死，剪開腹腔皮膚，ip 0.9%氯化鈉溶液2 mL，輕揉小鼠腹部。吸取腹腔沖洗液，滴片，于37℃溫育30 min后，于生理鹽水中漂洗，吹干，甲醇溶液固定5 min，晾干，瑞氏染色30 min，油鏡下觀察，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率（%）＝具有吞噬能力的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞觀察數(shù)×100%；吞噬指數(shù)＝吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/巨噬細(xì)胞觀察數(shù)[8，12]。

2.4.3 各組小鼠免疫器官指數(shù)測定 末次給藥后24 h處死小鼠，取脾和胸腺，用濾紙吸干水分后稱取質(zhì)量，并計(jì)算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)（mg/g）＝免疫器官質(zhì)量/體質(zhì)量[8，13]。

2.4.4 各組小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定 給藥開始后第1～3天，各組小鼠im PHA 10 mg/kg。末次給藥后剪尾，取血推片，瑞氏染色30 min，油鏡下觀察，共計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞100個(gè)，并計(jì)數(shù)其中轉(zhuǎn)化細(xì)胞（淋巴母細(xì)胞、過渡態(tài)細(xì)胞）數(shù)，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（%）＝轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)/100個(gè)×100%[12]。

2.4.5 各組小鼠血清溶血素水平測定 各組小鼠ip5%CRBC 0.2 mL免疫后，按“2.4.1”項(xiàng)下方法給藥，末次給藥后摘眼球取血，離心（離心半徑7.5 cm，3 000 r/min）10 min，取血清加入100倍生理鹽水稀釋。取稀釋血清1 mL，與5%CRBC混合后，在37℃恒溫箱中保溫30 min后，0℃冰箱中中止反應(yīng)。離心（離心半徑7.5 cm，3 000 r/min）10 min，取上清液于540 nm波長處測吸光度。溶血素水平以半數(shù)溶血值（HC50，評價(jià)免疫調(diào)節(jié)功能的指標(biāo)）表示，計(jì)算公式為HC50＝樣品的吸光度/ CRBC半數(shù)溶血時(shí)的吸光度×稀釋倍數(shù)[14]。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 水提取工藝測定結(jié)果

按“2.3.1”項(xiàng)下方法提取后，再按“2.2”項(xiàng)下方法測定多糖含量，結(jié)果，蟻獅多糖的含量為14.48%。

3.2 蛋白酶水解提取工藝測定結(jié)果

按“2.3.2”項(xiàng)下方法，以正交試驗(yàn)安排的不同因素水平進(jìn)行提取后，再按“2.2”項(xiàng)下方法測定多糖含量，結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 蟻獅多糖蛋白酶水解提取工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 1 Orthogonal test arrangement and results of protease hydrolysis extraction technology for polysaccharide from antlion

表2 蟻獅多糖蛋白酶水解提取工藝方差分析Tab 2 Variance analysis of protease hydrolysis extraction technology for polysaccharide from antlion

由直觀分析和方差分析可知，各因素對酶提工藝的影響順序?yàn)锳＞C＞B。方差分析結(jié)果表明，各因素對蟻獅多糖提取均無顯著影響。綜合生產(chǎn)成本考慮，確定蟻獅多糖酶提取工藝為A1B1C3，即40℃下用100 μg/g的木瓜蛋白酶提取3 h。此工藝下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果蟻獅多糖的平均含量為38.66%（RSD＜5%，n＝3）。

3.3 稀堿液提取工藝測定結(jié)果

按“2.3.3”項(xiàng)下方法，以正交試驗(yàn)安排的不同因素水平進(jìn)行提取后，再按“2.2”項(xiàng)下方法測定多糖含量，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 蟻獅多糖稀堿液提取工藝正交試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 3 Orthogonal test arrangement and results of diluted alkali extraction technology for polysaccharide from antlion

由直觀分析和方差分析可知，各因素對稀堿液提取工藝的影響順序?yàn)镃＞A＞B，因素C對蟻獅多糖提取有顯著影響（P＜0.05）。綜合生產(chǎn)成本考慮，確定最優(yōu)稀堿液提取工藝為A1B3C3，即80℃下用0.01 mol/L堿液提取3 h。此工藝下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果蟻獅多糖的平均含量為30.62%（RSD＜5%，n＝3）。

3.4 各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測定結(jié)果

與對照組比較，蟻獅多糖低、中、高劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)顯著升高（P＜0.05），詳見表5。

3.5 各組小鼠免疫器官指數(shù)測定結(jié)果

與對照組比較，蟻獅多糖低、中、高劑量組小鼠脾指數(shù)顯著升高（P＜0.05）、指數(shù)明顯降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)一定劑量依賴性（P＜0.05），詳見表5。

3.6 各組小鼠PHA刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化測定結(jié)果

與對照組比較，蟻獅多糖低、中、高劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表5。

3.7 各組小鼠血清HC50測定結(jié)果

與對照組比較，蟻獅多糖中劑量組小鼠血清HC50顯著升高（P＜0.05），結(jié)果詳見表5。

表5 各組小鼠免疫活性測定結(jié)果（s，n＝8）Tab 5 Determination results of immune activity of mice in each group（s，n＝8）

表5 各組小鼠免疫活性測定結(jié)果（s，n＝8）Tab 5 Determination results of immune activity of mice in each group（s，n＝8）

注：與對照組比較，＊P＜0.05Note：vs.control group，＊P＜0.05

組別對照組蟻獅多糖低劑量組蟻獅多糖中劑量組蟻獅多糖高劑量組HC5031.06±3.32 27.20±2.48 51.43±4.14＊30.12±3.85劑量，mg/kg 20 40 80吞噬百分率，% 17.50±2.45 30.50±5.45＊40.25±4.27＊33.50±3.51＊吞噬指數(shù)22.25±3.58 37.38±3.93 48.50±2.33＊38.25±5.60＊胸腺指數(shù)，mg/g 4.99±0.13 4.32±0.17＊4.17±0.16＊3.76±0.13＊脾指數(shù)，mg/g 5.40±0.09 6.40±0.19＊6.57±0.18＊7.28±0.11＊淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，% 76.38±5.88 78.88±4.79 80.50±3.59 77.38±5.93

4 討論

比較3種方法的蟻獅多糖提取率，蛋白酶水解提取法和稀堿液提取法均高于水提取法，說明多糖在蟻獅體內(nèi)可能多以糖蛋白形式存在，而酶和稀堿有助于糖和蛋白結(jié)合鍵的斷裂，利于多糖析出。蛋白酶水解提取法提取效果略優(yōu)于稀堿液提取法，結(jié)合生產(chǎn)成本及環(huán)境保護(hù)等因素，蟻獅多糖的提取工藝宜采取蛋白酶水解提取法的優(yōu)化工藝。

淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞，胸腺是T淋巴細(xì)胞分化成熟的場所，脾是人及哺乳動(dòng)物體內(nèi)重要的免疫器官，所以胸腺指數(shù)和脾指數(shù)是衡量機(jī)體細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)。多糖的免疫活性多見報(bào)道的為植物多糖[12-14]和菌類多糖[5，9]，而動(dòng)物類[8]尤其昆蟲類多糖則鮮見報(bào)道。本研究中，在給予小鼠一定劑量的蟻獅多糖后，小鼠的脾指數(shù)有了顯著增加，說明蟻獅多糖對小鼠的脾細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖作用。然而，對小鼠的胸腺指數(shù)而言，各劑量組與對照組比較都表現(xiàn)出不同程度的降低，而且在高劑量時(shí)，這種趨勢更加明顯，這與報(bào)道的猴頭菇多糖[15]、女貞子多糖[16]對胸腺的作用相似，但與人工蟲草多糖[17]、黃芪多糖[18]可增加胸腺質(zhì)量的結(jié)果不符。因此，蟻獅多糖的免疫機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

通過免疫活性的測定，發(fā)現(xiàn)蟻獅多糖具有一定的增強(qiáng)小鼠非特異性免疫、體液免疫功能，這可為進(jìn)一步深入開發(fā)蟻獅有效部位提供依據(jù)，對進(jìn)一步挖掘藥用昆蟲的價(jià)值及持續(xù)利用藥用昆蟲資源也有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Study on the Extraction Technology of Polysaccharides from Antlion and Its Immune Activity in vivo

WANG Yingjuan1，ZHANG Pei1，LI Zizhong2，LUO Liping2（1.Key Laboratory on Research and Development of Ethnic Medicinal Biological Resources，School of Biology and Chemistry，Xingyi Normal University for Nationalities，Guizhou Xingyi 562400，China；2.Institute of Entomology，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of polysaccharides from antlion and explore its effect on immune functions of mice.METHODS：Using content of polysaccharides as investigation index，the effects of extracting polysaccharides from antlion by water extraction method protease hydrolysis extraction（optimized by orthogonal test using extraction temperature，enzyme dosage，extraction time as indexes），and diluted alkali extraction（optimized by orthogonal test using alkali concentration，extraction temperature，extraction time as indexes）were compared.128 KM mice were randomly divided into 4 groups，then randomly divided into control group（normal saline），polysaccharides low-dose，medium-dose，high-dose groups（20，40，80 mg/ kg），8 in each group，iv in tail vein，0.2 mL/10 g，once a day，for 1 week，which were respectively used to determine the phagocytosis percentage and phagocytic index of peritoneal macrophages，spleen and thymus index，lymphocyte transformation rate and serum hemolysin levels.RESULTS：The contents of polysaccharides by 3 methods were 14.48%，38.66%，30.62%，respectively. The content of polysaccharides by protease hydrolysis extraction was the highest，the optimal extraction technology were as follows as using 100 μg/g papain extracting 3 h under 40℃.Compared with control group，phagocytosis percentage，phagocytic index，spleen index in polysaccharides low-dose，medium-dose，high-dose groups were significantly increased（P＜0.05），thymus index was significantly decreased（P＜0.05），while lymphocyte transformation rate had no significant changes（P＞0.05）；serum hemolysin in polysaccharides medium-dose group was significantly increased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Protease hydrolysis extraction is suitable for the extraction of polysaccharides from antlion，the optimal technology is reliable.Polysaccharides from antlion show activity in enhancing mice non-specific immunity and humoral immunity.

Antlion；Polysaccharide；Extraction method；Immune activity

Q969.97

A

1001-0408（2017）10-1338-04

2016-08-05

2017-02-02）

（編輯：劉明偉）

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（No.黔科合J字〔2012〕2323號(hào)）；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（No.黔科合中藥字〔2013〕5038號(hào)）；貴州省普通高等學(xué)校創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（No.黔教合人才團(tuán)隊(duì)字〔2013〕30號(hào)）

＊副教授，博士。研究方向：藥用昆蟲資源的研究與開發(fā)。電話：0859-3296551。E-mail：wangyj1982@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.11